胡椒PnCAD基因的克隆和表达分析

摘要

木质素在植物体中具有运输水分、支撑植株和加强植物体免受侵害等功能,是苯丙烷代谢途径的重要产物之一。其中肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)是该途径中重要的限速酶。本研究在胡椒转录组测序的基础上,用RACE法进行克隆,对PnCAD基因全长进行生物信息学分析,并对其蛋白进行理化性质、亚细胞定位和系统进化树等分析;最后运用实时荧光定量PCR进行分析。结果表明:克隆得到CAD基因的全长cDNA,长度为1364 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1071 bp,编码356个氨基酸,预测相对分子量为3.879 kDa,等电点为6.27,属于亲水性蛋白;含有3个N-糖基化特征序列和9个磷酸化位点,可能处于细胞质内。结构域分析发现,胡椒CAD蛋白含有NAD(P)结合位点、多个催化锌和结构锌结合位点。系统进化树分析表明,胡椒CAD与细辛CAD6亲缘关系最近,胡椒和细辛的同源性最高为76%,均隶属于比较原始的双子叶植物。通过荧光定量分析发现,黄花胡椒在辣椒疫霉菌侵染下表达量升高,在8 h达到最高值,约为对照的10倍;之后在24 h时出现小幅度升高,约为对照组的6倍,之后下降。‘热引1号’胡椒的表达量在侵染8 h时达到最低,之后缓慢上升。总体来说,所有时间下黄花胡椒基因表达量均高于‘热引1号’胡椒,且差异显著。本研究结果可为今后研究胡椒抗非生物胁迫功能提供参考,为PnCAD基因的功能研究提供理论依据。