构建过表达FNDC5慢病毒载体抑制平滑肌细胞的增殖与迁移

摘要

背景:Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5(fibronectin type Ⅲ domain containing 5,FNDC5)属于一种肌肉因子,主要表达于骨骼肌及其他肌肉较多的组织中,可通过结合不同受体影响多种细胞增殖与迁移.目的:构建过表达FNDC5基因的慢病毒载体,获得稳定转染FNDC5的平滑肌细胞系,并观察其对平滑肌细胞增殖与迁移的影响.方法:①体外培养血管平滑肌细胞,经鉴定合格后传代培养.②PCR扩增目的基因FNDC5,将目的基因构建入pLVX-mCMV-ZsGreen-IRES-Puro慢病毒载体中,在JM109感受态细胞中进行扩增,测序及鉴定合格后转染293T细胞,包装成过表达慢病毒颗粒并测定病毒滴度.将获得的重组慢病毒转染平滑肌细胞系,倒置荧光显微镜下观察细胞形态并计算转染效率,嘌呤霉素筛选获得稳转平滑肌细胞株.③将平滑肌细胞分为3组,分别为对照组、空载组和FNDC5过表达组,Real-time PCR和Western blot检测各组平滑肌细胞FNDC5 mRNA及蛋白表达,CCK-8和细胞划痕实验检测各组平滑肌细胞增殖活性及迁移能力.结果 与结论:①成功构建FNDC5过表达慢病毒,并得到稳定转染的平滑肌细胞株,平滑肌细胞转染效率为86％;②与对照组、空载组比较,FNDC5过表达组FNDC5 mRNA及蛋白表达显著升高(P＜0.001);③与空白组、空载组比较,FNDC5过表达组细胞增殖活性、迁移率明显下降(P＜0.05);④结果显示,得到FNDC5稳定转染的平滑肌细胞株,FNDC5过表达可抑制平滑肌细胞增殖与迁移.