提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法

摘要

背景：由于小鼠肝脏小、血管较细，其原代肝星状细胞分离的难度相对较大，且得率有限，难以满足体外实验需求。目的：建立小鼠原代肝星状细胞高效稳定的分离方法，提高小鼠原代肝星状细胞的得率与纯度，为研究肝纤维化的机制奠定实验基础。方法：取成年雄性C57BL/6小鼠，以无钙镁离子的前灌流液经门静脉充分灌注肝脏，再先后以1 g/L链霉蛋白酶和0.7 g/L Ⅳ型胶原酶灌注，使用Nycodenz进行梯度密度离心，获取中间层原代肝星状细胞，锥虫蓝染法观察肝星状细胞活力，流式细胞法检测细胞纯度，免疫荧光法检测Desmin表达，并于倒置显微镜下观察细胞培养3，5，7 d后的形态变化，PCR法检测培养3，5，7 d后α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白基因表达情况。结果与结论：①每只小鼠肝脏可获得肝星状细胞（5.5±0.4）×10^6个，锥虫蓝检测细胞活力均大于95%，流式细胞法检测细胞纯度为94%，免疫荧光检测细胞高表达Desmin；②随着体外培养时间的延长，可见原代肝星状细胞逐渐由圆形向星型发展；③随培养天数增长，α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达逐渐升高； ④结果提示，实验成功建立了高效分离小鼠肝星状细胞的方法，可为获得高纯度、高细胞活力的小鼠原代肝星状细胞提供技术方案，也为肝纤维化的机制研究提供技术保障。