应用基因调控方法抑制软骨细胞生成一氧化氮的可行性

摘要

目的:探讨用基因调控的方法抑制软骨细胞生成一氧化氮的可行性,为通过抑制一氧化氮生成治疗骨关节炎寻找新的途径和方法.方法:实验于2001-09/2002-03在华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室完成.根据基因调控和基因诱捕理论,培养大鼠软骨细胞,人工合成大鼠诱生型一氧化氮合酶基因上能够与核因子κB序列识别和结合并带有荧光标记的特异性序列核因子κB诱捕性双链寡核苷酸,同时合成诱生型一氧化氮台酶基因上不能够与核因子κB识别和结合的非特异性序列假诱捕性双链寡核苷酸作为对照,将假诱捕性双链寡核苷酸及1,2,4,8,10 μm诱捕性双链寡核苷酸转染入培养的大鼠软骨细胞,通过荧光显微镜观察其转染效率及降解情况,应用一氧化氮检测试剂盒及反转录聚合酶链反应的方法观察其对白细胞介素1诱导的软骨细胞一氧化氮生成及诱生型一氧化氮合酶mRNA转录的影响.结果:①双链寡核苷酸转染软骨细胞的观察结果:核因子κB诱捕性双链寡核苷酸及假诱捕性双链寡核苷酸能转染入软骨细胞胞核并能维持一定时间(48 h左右降解).②一氧化氮的检测结果:以重组人白细胞介素1β刺激的软骨细胞分泌量为100作对照,在未受白细胞介素1β刺激的情况下,软骨细胞分泌少量的一氧化氮(13.6±5.4);以白细胞介素1β刺激软骨细胞后,转染核因子κB诱捕性双链寡核苷酸为1μm,2μm时,软骨细胞分泌的一氧化氮与对照组相比无显著性;而在达到4μm时,一氧化氮分泌量差异即具有显著性(63.8±13.3,P＜0.01);此后,随诱捕性双链寡核苷酸浓度增加,软骨细胞分泌的一氧化氮的含量逐渐减少(寡核苷酸浓度为8μm和10 μm时);而在转染10μm的假诱捕性双链寡核苷酸后,软骨细胞合成一氧化氮的量并未减少.③诱生型一氧化氮合酶mRNA的表达结果:反转录聚合酶链反应测定诱生型一氧化氮合酶mRNA的相对表达量显示,软骨细胞未受白细胞介素1β刺激时,软骨细胞表达诱生型一氧化氮合酶mRNA为0.02±0.01,软骨细胞受白细胞介素1β刺激时,诱生型一氧化氮合酶mRNA高表达为1.2±0.16,在转染10 μm的假诱捕性双链寡核苷酸和1μm,2 μm的诱捕性双链寡核苷酸,诱生型一氧化氮合酶mRNA表达量与对照组无显著差异.而在浓度达到4μm时,差异即具有显著性(0.6±0.11,P＜0.01).此后,随诱捕性双链寡核苷酸浓度增加,诱生型一氧化氮合酶mRNA表达量逐渐减少.结论:双链寡核苷酸能够转染入软骨细胞,达到一定浓度的诱捕性双链寡核苷酸(4 μm)能抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞一氧化氮生成及诱生型一氧化氮合酶mRNA表达.应用诱捕性双链寡核苷酸通过基因调控的方式阻止了诱生型一氧化氮合酶基因上的一致性序列与核因子κB的结合,从而抑制了诱生型一氧化氮合酶mRNA的转录及诱生型一氧化氮合酶生成,为抑制诱生型一氧化氮合酶的生成提供了新的思路和方法.