差速贴壁法体外培养失神经骨骼肌肌源性干细胞的生物学特性

摘要

目的:探讨失神经过程中的肌源性干细胞的生物学特性,掌握其分离、培养及鉴定方法,了解其生长规律并进行体内定位.方法:实验于2004-01/2005-10华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科完成.选取清洁级3周龄昆明种小鼠5只,切断小鼠双侧坐骨神经,造成失神经损伤模型.采用Ⅺ型胶原酶和胰蛋白酶消化法及差速贴壁法分离细胞获取小鼠肌源性干细胞,进行体外原代和传代培养.观察细胞的形态,通过生长曲线分析肌源性于细胞的增殖能力,利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定.结果:①失神经骨骼肌内肌源性干细胞生长特性:失神经骨骼肌肌源性干细胞原代培养时细胞贴壁及生长较慢,1个月后才进行传代.传代培养3 d后部分细胞呈梭形,成簇状生长.7～10 d后大部分为梭形和多形状,细胞间相互出现成片融合,此后细胞生长速度放慢.②失神经骨骼肌肌源性干细胞生长曲线的绘制:细胞培养前3 d细胞生长慢,3 d后生长明显加快,7 d后生长明显放慢,进入平台期.③失神经骨骼肌内肌源性干细胞的表型鉴定:细胞质CD34和Sca-1染色均呈阳性,细胞核大.④失神经骨骼肌内肌源性干细胞的体内定位:CD34和Sca-1阳性细胞位于肌细胞和基底膜之间,细胞小,细胞数量较少.结论:采用差速贴壁法可从失神经骨骼肌内分离出肌源性干细胞,体外培养的肌源性干细胞具有良好的增殖能力,适用于组织工程和基因治疗.