鼠胚神经干细胞体外培养方法的优化

摘要

目的:神经干细胞能够分化为神经元和神经胶质细胞,但其纯化、培养技术尚不完善通过不同接种密度和传代方法,筛选优化神经干细胞的体外培养技术。方法:实验于2006-05/12在四川大学移植免疫实验室完成。①动物:选取清洁级孕12～16 d雌鼠,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法:取孕鼠胚胎脑皮质,胰蛋白酶+乙二胺四乙酸消化组织,分离神经干细胞,加入含B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的DMEM/F12培养基.传至第3代时.调整细胞密度至1×10~7L^(-1),1×10~8L^(-1),1×10~9L^(-1),1×10^(10)L^(-1)进行培养。另取原代培养7～10 d后的神经干细胞,收集形成的细胞球,机械吹打法传代是离心后用由粗到细的吸管轻柔吹打.或用带5号针头的无菌注射器吹打分离细胞.操作中避免产生气泡.使用注射器时吹打的次数保持5次。胰酶消化联合机械吹打法传代是离心后加入胰蛋白酶,37℃水浴10min,用由粗到细且经火焰抛光的吸管轻柔吹打.或用带5号针头的无菌注射器吹打.以胎牛血清终止消化。③实验评估:观察第3代神经干细胞生长状态.MTT法检测各密度下培养1,3,5,7 d时的增殖情况。计数两种传代方法亚代神经干细胞形成的克隆球数目,比较增殖效果。免疫荧光染包检测神经球巢蛋白、BrdU标记、神经元特异性烯醇化酶、胶质细胞原纤维酸性蛋白的表达。结果:①神经干细胞的培养和鉴定:从胚胎大鼠脑皮质分离培养出的细胞可聚集成球状.并在体外大量扩增和长期存活,巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质细胞原纤维酸性蛋白均呈阳性表达,免疫荧光染色可见大量BrdU标记的阳性细胞。②不同接种密度对神经干细胞增殖的影响:按1×10~9L^(-1)密度培养的细胞分裂增殖最为迅速.于第7天达高峰,且克隆球生成数量明显多于1×10~7L^(-1),1×10~8 L^(-1),1×10^(10)L^(-1)密度(P均<0.05)。③不同传代方法对亚代神经干细胞克隆增殖效果的影响:采用机械吹打法传代的神经干细胞所增殖形成的细胞球结合紧密,抛光玻璃管+注射器吹打后细胞球能较好地分开.但不能完全分散成单细胞.传代后细胞能够继续生长,并形成亚代神经干细胞球。经胰酶消化的神经球在机械吹打后也不能完全形成单细胞,且其亚代克隆的形成能力明显低于机械吹打法(P<0.05)。结论:①从胚胎大鼠脑皮质分离培养出的细胞具有神经干细胞特性,可诱导分化为神经元和星形胶质细胞②1×10~9L^(-1)为最佳细胞接种密度,机械吹打法亚代克隆的活性和增殖能力明显优于胰酶消化联合机械吹打法。