人角质形成细胞中K14基因及蛋白表达与角蛋白14反义寡核苷酸的抑制效应(英文)

摘要

背景:反义药物的研究仍然是当前生物医学领域较为活跃的热点之一,其具有高效特异的优势,作为基因治疗的途径已受到许多研究者的关注。目的:观察脂质体介导角蛋白14反义寡核苷酸对人角质形成细胞K14基因和蛋白表达及体外增殖活性的影响。设计:单一样本观察。单位:解放军第四军医大学西京医院皮肤科。材料:人表皮角质形成细胞、K14寡核苷酸基因片段(全硫代修饰,以上序列均由上海生工生物工程公司合成)。反转录酶、TaqDNA聚合酶均购自Invitrogen公司,K14单抗购自Antibody公司,SABC试剂盒购自博士德。EPlCS-PRO-FILEⅡ流式细胞仪(美国Coulter)。方法:人表皮角质形成细胞原代培养,3～10代用于实验,利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配K14寡核苷酸基因片段导入角质形成细胞,并设空白组作对照。应用流式细胞仪、反转录聚合酶链式反应和免疫组化方法检测反义寡核苷酸对角质形成细胞的细胞周期、K14基因和蛋白表达的影响。主要观察指标:寡核苷酸转染人角质形成细胞后对角质形成细胞增殖和K14表达的影响。结果:①反转录聚合酶链反应产物电泳显示:各组均出现特异的K14基因条带,反义组基因表达明显低于正义组、错义组和空白组。正义组、错义组和空白组K14/β-actin比值相近(P>0.05);而反义组明显低于前述3组(F=47.554,P<0.01)。②免疫组化法检测K14蛋白表达:培养的角质形成细胞均表达一定水平的K14,加入反义寡核苷酸(ASODN)后,K14表达明显减少,20μmol/L浓度的反义寡核苷酸即可显著抑制K14的表达;而对照细胞组K14的表达没有明显变化。③流式细胞仪检测DNA含量变化:经K14反义寡核苷酸处理细胞48h,可见细胞处于G1期细胞比例明显上升(74.6%),S期细胞比例明显下降(19.4%),而正义组,错义组及空白组均无此变化。结论:反义寡核苷酸可特异地抑制K14的合成,从而抑制人角质形成细胞的增殖。