核因子κB反义和诱骗寡核苷酸对平滑肌细胞增殖的作用

摘要

目的:观察离体血管平滑肌细胞和动物体内转染转录因子核因子κBp65诱骗性寡核苷酸和反义寡核苷酸对平滑肌细胞增殖及大鼠颈动脉球囊损伤后血管新生内膜的干预作用。方法:实验于2001-05/2003-03在上海交通大学医学院细胞生物学实验室和瑞金医院心血管实验室完成。建立大鼠颈动脉球囊损伤模型。SD大鼠126只随机数字表法分为7组,每组18只。正常对照组(除球囊损伤外,其余手术操作与其他组相同),反义组,正义组,诱骗组,诱骗对照组,反义加诱骗联合干预组,模型组。每组又分为术后6h,1,3,5,7,14d6个时相点,每个时相点3只。阳离子脂质体介导的核因子κBp65诱骗性寡核苷酸、反义寡核苷酸转染血管平滑肌细胞及局部定向转送至球囊损伤血管内,观察大鼠颈动脉球囊损伤后5-溴脱氧尿嘧啶掺入试验结果,大鼠颈动脉球囊损伤且转染不同寡核苷酸后的血管增殖标记物检测结果,大鼠颈动脉球囊损伤后核因子κBp65蛋白合成WesternBlot检测结果。结果:纳入动物126只,均进入结果分析。①核因子κB的反义寡核苷酸组、诱骗性寡核苷酸组、反义寡核苷酸加诱骗性寡核苷酸组细胞核蛋白增殖细胞核抗原的表达低于阳性对照组,差异均有显著性意义(分别为348.55±39.63,369.05±71.56,309.33±12.86,635.16±89.95,P<0.05);反义寡核苷酸组低于正义寡核苷酸组,差异有显著性意义(分别为348.55±39.63,752.11±76.43,P<0.05);诱骗性寡核苷酸组低于诱骗对照组,差异有显著性意义(分别为369.05±71.56,818.31±102.29,P<0.05);反义寡核苷酸和诱骗性寡核苷酸联合转染较单独作用显示增强的抗细胞增殖效应趋势,统计学上无差异。②血管球囊损伤后1d5-溴脱氧尿嘧啶掺入明显高于正常对照组和损伤后6h[分别为(22.52±0.21)%,(0.02±0.01)%,(4.16±0.22)%,P<0.05],球囊损伤后3d较其他时间点5-溴脱氧尿嘧啶表达最明显,为(48.71±0.22)%,差异均有显著性意义(P<0.05)。3d后5-溴脱氧尿嘧啶表达逐渐降低。③球囊损伤后3d正义组、反义组、诱骗组、诱骗对照组、反义加诱骗联合干预组、模型组增殖细胞核抗原表达明显高于正常对照组,差异均有显著性意义(分别为41.63±4.06,22.57±2.62,21.64±2.98,38.89±6.33,21.06±2.89,41.48±3.09,4.49±0.79,P<0.01);反义组低于正义组(P<0.05);诱骗组低于诱骗对照组(P<0.05);反义加诱骗联合干预组略低于反义组、诱骗组,但无统计学差异;反义组、诱骗组、反义加诱骗联合干预组增殖细胞核抗原表达显著低于模型组,差异均有显著性意义(P<0.05)。④球囊损伤后3d正义组、反义组、诱骗组、诱骗对照组、反义加诱骗联合干预组、模型组5-溴脱氧尿嘧啶表达明显高于正常对照组,差异均有显著性意义(分别为56.23±2.00,28.97±1.14,26.64±2.89,48.89±2.28,21.06±2.89,51.48±3.09,14.49±0.79,P<0.05);反义组低于正义组(P<0.05);诱骗组低于诱骗对照组(P<0.05);反义加诱骗联合干预组低于反义组、诱骗组,差异有显著性意义(P<0.05);反义组、诱骗组、反义加诱骗联合干预组5-溴脱氧尿嘧啶表达明显低于模型组,差异均有显著性意义(P<0.05)。⑤大鼠颈动脉损伤7d后,模型组、正义组、反义组、诱骗对照组、诱骗组、反义加诱骗联合干预组核因子κBp65蛋白表达高于正常对照组,差异均有显著性意义(分别为1.86±0.03,1.67±0.10,1.25±0.01,1.51±0.01,1.41±0.07,1.19±0.02,0.84±0.01,P<0.05)。反义组低于正义组(P<0.05),诱骗组与诱骗对照组之间无差异。反义加诱骗联合干预组核因子κBp65蛋白表达低于诱骗组(P<0.05),与反义组相比无统计学差异。反义组、诱骗组、反义+诱骗联合干预组低于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:核因子κBp65诱骗寡核苷酸和反义寡核苷酸均能抑制血管平滑肌细胞增殖。大鼠颈动脉球囊损伤后,血管细胞显示动态的增殖效应。核因子κBp65反义寡核苷酸抑制p65蛋白质生成,诱骗寡核苷酸对核因子κB生成无作用。