SV40T抗原荧光真核表达载体构建及在胰岛细胞中的表达

摘要

背景:有研究表明小鼠胰岛细胞永生化以后增殖能力明显增强,但功能减弱。然而,小鼠的端粒和人类的端粒有差别,大鼠的端粒与人类的相似。目的:设计和构建SV40T荧光真核表达载体,导入大鼠胰岛细胞中进行表达鉴定。设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-10/2008-04在深圳市人民医院中心实验室完成。材料:选用成年雄性SD大鼠2只;pCMV-SV40T质粒;pSC-A质粒;pIRES2-ZsGreen1质粒。方法:用NotⅠ和XhoⅠ将SV40T片断从pCMV-SV40T质粒上双酶切下来,回收后克隆到载体pSC-A中成为pSC-SV40T,再用XhoⅠ和SacⅡ将SV40T片断双酶切下来,回收后正向克隆到荧光真核表达载体pIRES2-ZsGreen1中,酶切鉴定重组质粒;用脂质体转染的方法将构建的载体导入原代培养的大鼠胰岛细胞;检测SV40T基因在胰岛细胞中的表达。主要观察指标:绿色荧光蛋白的表达;SV40T的转录和翻译。结果:①经XhoⅠ和SacⅡ双酶切后,重组质粒被切成5.3kb和2.4kb2个片段,与理论预期长度相符。②pIRES2-ZsGreen1-SV40T重组基因经脂质体法转染,G418筛选,在胰岛细胞内可见绿色荧光,反转录-聚合酶链反应及细胞免疫荧光染色可见SV40T mRNA转录及其蛋白的表达。结论:实验成功构建了SV40T荧光真核表达载体,并可在大鼠胰岛细胞中表达。