人神经干细胞移植到缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的存活及分布

摘要

目的：新生儿缺氧缺血性脑病是导致脑性瘫痪的重要原因,至今缺乏有效疗法。将体外培养的人神经干细胞经脑室移植入缺氧缺血性脑损伤新生鼠,观察植入细胞在宿主脑内的存活、迁移及分化。方法：实验于2005-01/09在解放军海军总医院儿科实验室完成。①对象：神经干细胞来源于孕12周流产的人胎儿脑组织,孕妇签署知情同意书,符合医院伦理委员会规定。清洁级SD新生鼠80只,随机数字表法分为细胞移植组、模型对照组,40只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：取人胚胎脑组织,机械分散法分离单个核细胞,接种于添加表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中,获取生长旺盛的人神经干细胞球,制成单细胞悬液,浓度约为5.0×10^11 L^-1,培养6d后行PKH标记用于植入后示踪。两组新生鼠均建立缺氧缺血性脑损伤模型,造模后3d,细胞移植组损伤侧脑室缓慢注入5μL人神经干细胞悬液,模型对照组于相同部位注入等量生理盐水。③实验评估：取未经PKH标记的细胞球,通过免疫细胞化学染色鉴定巢蛋白的表达及其向神经元、星形胶质细胞的分化情况。分别于细胞移植后1,2,4周及3个月,常规取脑组织,行免疫组织化学和荧光分析,观察植入后细胞存活及分布情况。结果：在造模及细胞移植过程中,因麻醉、出血细胞移植组新生鼠死亡5只,模型对照组死亡7只,存活率85%～90%。①神经干细胞的鉴定及分化：80%活细胞巢蛋白呈阳性表达,并可分化为神经元、星形胶质细胞。②神经干细胞植入后存活及分布情况：植入后1周,神经丝蛋白阳性细胞多位于损伤侧皮质及海马处,纹状体、脑干、小脑、嗅球也有少量分布。植入后2周,海马和皮质可见神经丝蛋白阳性细胞,胞体伸出的神经微丝更长,细胞数量与1周时基本相似。植入后4周及3个月时PKH阳性细胞数量明显减少。结论：在含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中形成的人神经干细胞球,具有良好的增殖能力,可分化为神经元,移植至缺血缺氧新生鼠脑中能够向损伤区迁移,分布范围广。