血管生成素1通过整合素对大鼠骨髓间充质干细胞的黏附、活力及抗凋亡影响

摘要

背景:前期实验已证实骨髓间充质干细胞表面存在整合素受体,但血管生成素1是否能通过整合素受体促进骨髓间充质干细胞的生存、抗凋亡目前尚不明确. 目的:探讨血管生成素1对大鼠骨髓间充质干细胞黏附、活力、抗凋亡的影响,并初步分析其信号转导机制.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-01/10在厦门大学附属中山医院开放实验室完成.材料:清洁级SD大鼠40只,由中科院上海实验动物中心提供.人血管生成素1为R&D公司产品.方法:密度梯度离心结合贴壁分离法体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,第3～6代细胞用于实验.分别以不同的基质包被24孔培养板1 h,清洗后再加入单细胞悬液,设立7组:第1组作为对照,以含0.1%牛血清白蛋白的PBS包被:第2～4组分别以玻粘连蛋白、纤维粘连蛋白、血管生成素1包被;第5～7组单细胞悬液预先分别与乙二胺四乙酸、β1抗体、RGD抗体孵育10 min后再加入24孔板,行血管生成素1包被.主要观察指标:通过黏附测定、锥虫蓝染色、MTT试验、Hoechst染色和Annexin V/PI法检测血管生成素1对骨髓间充质干细胞的黏附、活力、抗凋亡等生物学效应,结合整合亲抗体和信号转导阻滞剂通过Western blotting法检测磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B、总丝氨酸/苏氩酸蛋白激酶B、Bcl-2和B-actin水平.结果:成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定其纯度达98.3%.黏附试验显示与对照组比较,培养1,2,3 d血管生成索1均能促进骨髓间充质干细胞的黏附(P<0.01),该效应能被乙二胺四乙酸、整合素亚单位β1抗体和RGD抗体所抑制(P＜0.01).血管生成素1能促进骨髓间充质干细胞在血清饥饿下的存活(P<0.01)、增殖(P＜0.01)和提高磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B、Bcl-2的表达来拮抗紫杉醇诱导的凋亡(P＜0.01),RGD抗体能抑制上述作用.结论:血管生成素1可与整合素受体结合促进骨髓间充质干细胞的黏附、存活和增殖,并通过上调磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B和Bcl-2的表达发挥抗凋亡作用.