TNF-α，G-CSF及VEGF对大鼠骨髓间充质干细胞表面黏附分子L-选择素和血管细胞黏附分子-1表达影响的研究

摘要

目的：研究大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，MSCs)经不同浓度的肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor alpha，TNF-a)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony-stimulating factor，G-CSF)及血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)预处理后不同时间段，其表面黏附分子L-选择素(L-selectin，CD62L)和血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1，CD106)的表达的变化，以及其表达变化与细胞因子浓度之间的关系，从而为经细胞因子预处理的MSCs用于移植治疗心力衰竭提供一个最佳的细胞因子浓度，为提高移植成功率打下基础。 方法： 1．大鼠MSCs的培养：采用密度梯度离心法收集大鼠MSCs并用贴壁培养法对其进行扩增和纯化。 2．大鼠MSCs的鉴定：采用免疫组化的方法进行细胞鉴定。 3．细胞因子预处理：于不同孔板细胞中加入不同浓度TNF-a(浓度分别为100pg/ml、1ng/ml和10ng/ml)、G-CSF(浓度分别为1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml)和VEGF(浓度分别为 1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml)分别作用12小时和24小时。 4．大鼠MSCs的消化分离以及标记：将贴壁生长的大鼠MSCs经消化后加入PBS溶液进行洗涤离心，收集细胞，使之成为单细胞悬液，后加入荧光标记的流式抗体，于暗箱孵育三十分钟。 5．数据记录：采用流式细胞仪(flow cytometer，FCM)对大鼠MSCs表面的黏附分子CD62L和CD106的表达进行检测。 结果： 1．培养的大鼠MSCs呈成纤维细胞样表型，贴壁生长，经扩增传代后细胞呈纺锤样，分布均匀，其余血细胞几乎消失，经免疫细胞化学法鉴定CD44和CD90呈阳性，CD45和CD34呈阴性，为大鼠骨髓间充质干细胞。 2．经TNF-a预处理12小时的大鼠MSCs经流式细胞仪检测其表面CD62L和CD106均成阳性表达的细胞占所检测细胞的百分比与未加入任何细胞因子预处理的空白组大鼠MSCs相比较，当TNF-a浓度分别为100pg/ml时，1ng/ml时，10ng/ml时，与空白组比较P=0.029(P<0.05)，不同浓度组间比较P=0.007(P<0.01)；而作用24小时后其CD62L，CD106的双阳性表达率在浓度分别为100pg/ml，1ng/ml， 10ng/ml时，与空白组比较P=0.029(P<0.05)，不同浓度组间比较P=0.007(P<0.01)，差异均有统计学意义。 3．用G-CSF预处理12小时的大鼠MSCs其表面CD62L和CD106双阳性表达百分比在其浓度分别为1ng/ml，10ng/ml和100ng/ml时表面CD62L和CD106双阳性表达百分比与空白组相比P=0.029(P<0.05)；处理24小时后其表面CD62L，CD106双阳性表达率与空白组相比P=0.029(P<0.05)；不同浓度组间比较P=0.007(P<0.01)，差异均有统计学意义。 4．用VEGF预处理12小时的大鼠MSCs表面CD62L和CD106双阳性表达百分比在浓度为1ng/ml时，与空白组比较P=(P>0.05)，10ng/ml时表面CD62L和CD106双阳性表达百分比与空白组比较P=0.886(P>0.05)，在浓度为100ng/ml时表面CD62L和CD106双阳性表达百分比与空白组比较P=1(P>0.05)；处理24小时后，各浓度组表面CD62L，CD106的双阳性表达率与空白组相比较，其P值分别为0.486(P>0.05)，1(P>0.05)和0.886(P>0.05)，差异均无统计学意义。不同浓度组间P=0.926(P>0.05)，也无统计学意义． 5．12小时和24小时两个预处理时间点之间相比较．P>0.05，差异无统计学意义。 结论： 1．经不同浓度TNF-a和G-CSF预处理的大鼠MSCs表面CD62L和CD106表达较空白组要高，并且随着其浓度的升高大鼠MSCs表面CD62L和CD106的表达也相应升高。 2．VEGF对大鼠MSCs表面CD62L和CD106表达无明显影响。

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人骨髓间充质干细胞的特性及在细胞，基因疗法中的应用(综述)