细胞外调节蛋白激酶信号通路调控牙周膜干细胞内皮分化的机制研究

摘要

目的探讨细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）通路在牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSC）内皮向分化中的作用,为PDLSC分化调控提供实验基础。方法使用血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor,VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,b-FGF）联合诱导PDLSC向内皮细胞分化（诱导组）,对诱导分化的细胞使用ERK1/2磷酸化阻断剂U0126进行处理（诱导+U0126组）,同时用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）作为对照（诱导+DMSO组）,空白对照组为未经诱导的PDLSC;蛋白质印迹法检测诱导组0、1、3、6及12 h的胞内磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）表达水平;各组诱导7 d后提取细胞RNA,实时荧光定量PCR法检测细胞内CD31、血管内皮钙黏素（vascular endothelial-cadherin,VE-cadherin）和VEGF mRNA的表达情况;各组诱导14 d,流式细胞计数法检测CD31+和VE-cadherin+细胞比例,基质胶管腔形成实验检测细胞的管腔形成能力。计量资料采用均值±标准差表示,两组间比较采用独立样本t检验;多组间比较采用单冈素方差分析。结果诱导1、3 h后p-ERK1/2与ERK1/2比值分别升高至1.24±0.12、1.03±0.24,均显著高于诱导前（0.58±0.17）（P＜0.01）;实时荧光定量PCR结果显示,诱导+U0126组CD31、VEGF mRNA相对表达水平分别降至0.09±0.18、0.49±0.17,均显著低于诱导组细胞（P＜0.05）;流式细胞检测结果显示,诱导+U0126组CD31+、VE-cadherin+细胞比值分别降至5.22±0.85、3.56±0.87,均显著低于诱导组细胞（P＜0.05）;基质胶管腔形成实验显示诱导组的分支节点数、管腔数目、管腔长度分别升高至62.3±10.0、145.0±14.8及（32 129.7±4413.9）像素,而诱导+U0126组分别下降至7.0±2.7、33.5±6.4及（15 951.0±758.1）像素,均显著低于诱导组（P＜0.05）。结论 PDLSC内皮分化过程受ERK通路正向调控,阻断ERK1/2磷酸化可以抑制PDLSC的内皮分化能力。