中山病病毒qRT-PCR与RT-PCR检测方法的建立及应用

摘要

中山病病毒(CHUV)是一种严重危害犊牛神经系统的虫媒病毒,自2012年首次从我国云南师宗分离后,相继在广西与广东等地区也分离到该病毒。为建立CHUV的检测方法,本研究根据CHUV编码VP2蛋白的Seg-2基因序列设计引物和探针,通过条件优化建立了检测CHUV的荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)和常规RT-PCR法。利用建立的qRT-PCR和RT-PCR分别检测CHUV、流行性出血病病毒、阿卡斑病毒、蓝舌病病毒和牛流行热病毒,结果显示除了均能检测CHUV以外,两种方法对其他病毒均无特异性扩增;利用两种方法对质粒标准品pLB-CHUV/V144/Seg-2(1×10^(0)拷贝/μL~1×10^(9)拷贝/μL)进行检测,结果显示两种方法的检测下限可分别达到10拷贝/μL(qRTPCR)与100拷贝/μL(RT-PCR);重复性试验结果显示,qRT-PCR的批内和批间变异系数均小于1%。利用这两种方法分别检测2019年5月~11月隔周采集3头感染CHUV哨兵牛的各25份共计75份的血液样品并计算二者的符合率;同时利用C-ELISA方法检测3头牛对应血清样品的CHUV抗体。结果显示,qRT-PCR检测到30份阳性样品,45份阴性样品;RT-PCR检测到22份阳性样品,53份阴性样品。两种方法的总符合率为89.33%;相比较于C-ELISA方法,qRT-PCR方法能在动物感染CHUV的早期(约早2周)检测出病毒核酸,更适用于检测病毒载量较低的血液样品,而RT-PCR的扩增产物可以通过测序了解待测病毒的遗传信息。本研究建立的两种检测方法可以互补使用,为CHUV的早期检测和流行病学研究等提供了快速、方便、可靠的技术支撑。