五重荧光定量RT-PCR检测甲型流感病毒方法的建立和应用及2010～2013年杭州地区人H3N2病毒流行病学分析

摘要

目的:
　　建立一种快速、敏感、特异的五重荧光定量RT-PCR方法检测甲型流感的不同亚型，并对2010～2013年杭州地区甲型流感H3N2进行分子流行病学调查，通过选择压力分析为疫苗研制提供依据。
　　方法:
　　1.设计甲型禽流感病毒基质蛋白(M)区、H3、H5、H7及内参基因(RNaseP，RP)的引物及Taqman探针，并对RT-PCR反应体系中，五套引物及探针的浓度进行优化。
　　2.合成各基因标准品片段，将其连接到质粒载体PmdTM19-T Simple Vector上进行转化和培养。经鉴定后提取质粒DNA，利用NanoDrop ND-2000核酸检测仪测量质粒DNA的浓度，确定DNA的拷贝数作为敏感度的标准品定量母液。根据实验需要，将标准品定量母液稀释至所需最高浓度(107copies/mL)，并连续10倍稀释至最低浓度(102copies/mL)，然后用本方法和WHO推荐的方法进行灵敏度比较。
　　3.在本方法的反应体系中加入其它18种呼吸道病原微生物[乙型流感病毒，禽流感H5N3、H5N1、H9N2病毒，人副流感病毒Ⅰ～Ⅲ型，呼吸道合胞病毒A和B型，肺炎支原体，铜绿假单胞菌，肺炎克雷伯菌，鲍曼不动杆菌，金黄色葡萄球菌，白念珠菌]提取的模板，检测反应体系的特异性。
　　4.将确定好的各质粒DNA浓度，根据实验需要，稀释至所需要的浓度(106copies/mL)，连续三次10倍稀释至(104copies/mL)，用本方法分别检测三次，检测反应体系的（批内）重复性，并与WHO推荐方法的结果进行比较。
　　5.用本方法对262例疑似患者与正常人的痰液标本进行检测，并与上海之江生物有限公司生产的市售试剂盒的方法结果比较。
　　6.2010年1月至2013年12月浙江大学附属第一医院流感监测网络相关数据，分别采用研究试剂所有病例的咽拭子均进行H3N2流感病毒检测，并经过血凝抑制实验和流感病毒核酸监测证实。
　　7.病原学检测:样本先进行流感病毒核酸检测，采用五重RT-PCR检测试剂盒。
　　8.序列收集:所有H3N2的HA(hemagglutinin)与NA(neuraminidase)基因完整序列均在NCBI上搜索查找获取，搜索关键词分别为:“China”，“Hangzhou”，“Hong Kong”加“H3N2 HA gene complete cds”,“H3N2 NA gene complete cds”，香港地区H3N2基因序列并入中国整个国家序列中。
　　9.HA与NA基因序列筛选与比对:依据病毒的分离地、时间、宿主为前提条件进行整合，条件相同序列只取一条。H3N2基因序列按照地区分为中国HA(133)、杭州HA(69)和杭州NA(69)三组。
　　10.分子钟与人口感染动力学分析:利用jModeltest软件找出序列最适碱基替换模型，按照手册中要求参数设置(http://code.google.com/p/jmodeltest2)。再使用Beast软件中贝叶斯MCMC(Bayesian Markov chain Monte Carlo)法对数据集进行碱基替换速率、最近共同祖先(Time of most recent common ancestor, TMRCA)和Skyline plot分析，依据操作手册中要求的参数(http://beast.bio.ed.ac.uk/Tutorials/)进行设置，我们建立一个严格分子钟的指数生长模型，通过Tracer软件对所得结果进行分析，并规定有效样本大小（ESS）＞200，最终计算分子钟（碱基替换速率）与时间人口感染动力学关系图，用Beast软件包中TreeAnnotator程序，计算获最大可信树（MCCT,），用FigTree对所得到的树进行编辑，获得H3N2病毒的HA基因在时间标尺与地理位置上的进化图。
　　11.甲型流感病毒H3N2选择压力分析:选择压力(dN-dS)可以反映病毒在收到外界环境进行选择时的进化情况，其中，dN（non-synonymous substitutions）代表非同义突变率，dS(synonymous substitutions)表示同义突变率。选择压力计算时以密码子发生非同义突变率dN与同义突变率dS的差值来确定选择的方向性，中性选择(dN=dS，dN-dS=0)，正向选择(dN-dS＞0)，净化选择（负向选择，dN-dS＜0）。
　　12.与选择压力（正向选择）相关的蛋白质表达:在PDB数据库中找出与H3N2基因密码子相似程度较高(＞30％)的蛋白质结构，以此蛋白质结构进行同源建模，比较各选择压力位点下的蛋白质结构的变化。分别在蛋白质空间三维结构图中进行标记。
　　结果:
　　1.引物与探针的设计与浓度优化:引物与探针浓度采用矩阵法进行，以获得的Ct值较小而荧光强度最大的浓度为反应体系最合适浓度。
　　2.五重荧光定量RT-PCR反应体系的灵敏度:五重荧光定量RT-PCR反应在检测甲型禽流感病毒基质蛋白(M)区、H3、H5、H7及RNase P的合成片段时，各自灵敏度与WHO推荐的方法一致，均达到了在102copies/mL时能扩增出条带。
　　3.五重荧光定量RT-PCR反应体系的特异性:将上述18种呼吸道病原菌的核酸提取物作为模板分别加入多重荧光定量RT-PCR进行测定，除流感病毒出现很好的阳性结果外，其它所有病毒的检测结果均呈阴性。特异性达到了100％。
　　4.五重荧光定量RT-PCR反应体系的重复性（批内）:不同浓度核酸各自的检测Ct值标准差在0.193～0.451之间，变异系数(CV)最高达1.999％，本方法具有较好的批内重复性。
　　5.五重荧光定量RT-PCR反应体系的检测符合率:使用本方法与已有试剂对临床262例疑似患者和正常人的痰液标本应用多重荧光定量RT-PCR方法进行检测。
　　6.2010～2013年杭州地区H3N2感染率分析，不同年度间H3N2感染率差异具有统计学意义(x2=14.004，P＜0.05)，不同性别和年龄组间差异无统计学意义(x2=3.552，x2=2.691，P＞0.05)。
　　7.我国流行甲型流感病毒H3N2的HA基因碱基替换速率为1.6584×10-3(95％可信区间:1.5325×10-3～1.7988×10-3），TMRCA:1945年（95％可信区间:1940～1952年），人口感染规模评价出现了两次高峰且感染率总趋势呈现上升状态。
　　8.通过SLA法计算可得到阳性选择位点4个，14，153，209，278。阴性位点有238个。
　　结论:
　　1.多重荧光定量RT-PCR技术是利用TaqMan技术在普通PCR原有的一对特异性引物基础上增加了一条特异性的荧光双标记探针。利用该探针能与病原核酸特异性结合，而且结合部位位于引物结合区域，探针的5'端和3'端分别标记不同的荧光素，在PCR扩增过程中，利用检测系统中荧光量的变化，通过检测仪检测并记录荧光信号的变化判定检测结果，我们利用此原理建立了多重荧光RT-PCR法检测不同的流感亚型。
　　2.检测方法的评价:通过标准毒株与临床样本的检测比较，发现我们建立的多重荧光RT-PCR特异性和灵敏度均达到了WHO推荐方法的特异性和灵敏度水平，而且我们的方法更快速，简便，并只需一次反应可同时检测甲型禽流感病毒和H3、H5、H7不同甲型禽流感不同亚型。
　　3.临床标本验证:通过分别使用我们试剂与之江在售试剂，同时检测临床病人与正常人标本后，我们得出两者符合率达到了100％。
　　4.通过对该方法的多角度评价，可知该方法具有快速、稳定、灵敏度和特异性高、重复性好的特点，对于临床上检测流感病毒及其不同亚型具有一定的意义。
　　5.我们推测2012年后的H3N2病毒株可能是其他省份病毒迁徒所致;2013年病毒株HA与NA基因序列，均处于2012年病毒株树分支的下级，我们推断2013年的病毒株为2012年病毒株复苏后感染再传播，2012年H3N2病毒株感染后，使部分感染人群产生获得免疫，对于此病毒株再次感染具有一定的保护作用，致使2013年杭州地区H3N2病毒流感样人群中感染率下降。
　　6.H3N2基因碱基置换速率为1.6525×10-3(95％可信区间:1.4796×10-3～1.8287×10-3)，要明显低于H1N1（7.06×10-3，95％可信区间:5.4×10-3～8.8×10-3）、H5N1（8.87×10-3，95％可信区间:7.0×10-3～10.72×10-3）等高致病性禽流感的碱基置换速率，这也是H3N2在我国流行的感染病毒株，多以低变异株为主的主要原因。由碱基置换速率我们推测H3N2病毒H3基因的产生时间:1945年（95％可信区间:1940～1952年），由于H3N2病毒存在一组未在人类感染的病毒进化分支，因此剔除未感染人病毒组，计算人感染H3N2的H3基因产生时间为:1960年(95％可信区间:1957～1962年)与实际H3N2流行发生时间相符。同时H3N2病毒在我国感染的规模与时间的分布出现了两次高峰且感染率总趋势呈现上升状态。
　　7.可将HA1基因的153(137)位于A抗原区，209(193)位于B抗原区，278(262)位于E抗原区，作为研制H3N2流感疫苗的依据，在H3N2流行中应重点观察该病毒在这些区域的变异情况。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语

前言

第一部分 甲型流感病毒检测的方法学建立(五重RT-PCR法检测甲型流感病毒)

1 材料

2 方法

3 结果

4 分析与讨论

5 结论

第二部分 2010~2013年杭州H3N2流行病学调查与基因进化分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论与分析

5 结论

第三部分 国内流行的甲型流感H3N2病毒HA基因进化分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论与分析

5 结论

第四部分 国内流行的甲型流感H3N2病毒HA基因选择压力分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论与分析

5 结论

参考文献

甲型流感H3N2实验室检测与流行病学概述

作者简历及在学期间所取得的科研成果