禽致病性大肠杆菌fdtACB基因缺失株的生物学特性研究

摘要

为研究O抗原侧链岩藻糖合成酶基因fdtACB对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究以O_(2)血清型APEC DE17为亲本株,通过Red同源重组构建fdtACB基因缺失株与回补株,经PCR及测序鉴定确认缺失株ΔfdtACB和回补株CΔfdtACB均正确构建。采用硝酸银染色法鉴定细菌脂多糖(LPS)图谱,采用western blot鉴定缺失株与O_(2)血清型O因子血清的反应性。硝酸银染色法结果显示,ΔfdtACB缺失株未产生与野生株一样完整的LPS图谱,表现为部分O抗原梯状条带缺失和移位;western blot结果显示,ΔfdtACB与大肠杆菌O_(2)血清型O因子血清无反应条带。各菌株培养16 h后每隔1 h测定OD600nm值,绘制生长曲线;于半固体培养基培养各菌株,通过测量细菌运动圈直径分析各菌株的运动能力,通过结晶紫染色法检测各菌株生物被膜(BF)形成能力,结果显示,ΔfdtACB缺失株、野生株和回补株间生长速率无明显差异(P>0.05);与野生株相比,ΔfdtACB缺失株的运动能力显著降低(P<0.01),BF形成能力显著升高(P<0.01)。以上结果表明fdtACB影响细菌O抗原完整性、运动及BF的形成。将各菌株分别感染DF-1细胞后通过细菌计数分析APEC对细胞的黏附及侵袭力,结果显示,ΔfdtACB对DF-1细胞的黏附及侵袭力均较野生株极显著降低(P<0.01)。以不同浓度各菌株腹腔注射感染大蜡螟后,根据5 d内各组大蜡螟死亡数量计算各菌株LD50,结果显示,除高剂量各菌株外,其它剂量各菌株注射后,ΔfdtACB组大蜡螟死亡数较其它组少,经计算野生株LD50为1.85×10^(2) cfu/mL,缺失株LD50为9.16×10^(2) cfu/mL,回补株LD50为8.0×10^(1) cfu/mL,缺失株致病力比野生株降低约5倍,表明fdtACB影响细菌感染性和致病力。综上所述,本研究首次证实大肠杆菌岩藻糖合成酶FdtACB参与O_(2)型APEC O的抗原合成,在细菌运动、BF形成和感染过程中发挥作用,该结果对掌握APEC O抗原侧链的生物学功能具有重要意义。