原纤维蛋白1在猪耳软骨细胞工程化软骨组织中的表达及作用

摘要

目的 探讨原纤维蛋白1(FBN1)在猪耳软骨细胞工程化软骨组织中的表达情况,以及过表达FBN1后对软骨细胞表型和细胞外基质表达的影响.方法 取3只长枫杂交猪单侧耳廓软骨,提取软骨细胞扩增至第2代,以6.0× 107/ml的密度(200 μl)接种于直径为10 mm、厚2 mm的聚羟基乙酸-聚乳酸(PGA-PLA)支架材料上,体外培养5周,构建9块细胞材料混合物组织块;将6块细胞材料混合物植入3只裸鼠体内,每只2块,培养10周,构建工程化软骨组织6块.HE染色分别检测3块体外培养5周的细胞材料混合物及裸鼠体内培养10周后的组织工程化软骨形态;取3块2 cm×1 cm大小的另一侧猪耳软骨组织及3块1.0 cm×0.5 cm大小的工程化软骨组织提取RNA,通过qPCR检测二者FBN1 mRNA表达差异;取0.5 cm×0.5 cm大小的另一侧猪耳软骨组织及工程化软骨组织各3块,利用免疫组织化学染色检测二者FBN1在蛋白水平的表达及分布差异;在第2代猪耳软骨细胞中转染空载体质粒及FBN1过表达质粒,利用实时荧光定量PCR检测软骨细胞外基质相关基因的表达变化,实验重复3次.所得数据用Graph Pad Prism 6.0进行双尾非配对t检验分析,P＜0.05为差异具有统计学意义.结果 HE染色结果显示:体外培养5周时,工程化软骨组织中可见大量软骨细胞及小的软骨陷窝,体内培养10周后,工程化软骨组织中形成明显软骨陷窝;工程化软骨组织FBN1 mRNA的相对表达量(0.001 41±0.000 28)较正常猪耳软骨组织(0.00358±0.000 34)显著降低,差异有统计学意义(t=4.913,P=0.008);正常组织中FBN1分布于软骨陷窝及软骨膜处,而工程化软骨组织中多分布于软骨膜处,越接近软骨组织中心越少;FBN1过表达组中FBN1 mRNA相对表达量为0.018 03±0.000 64,而空载体对照组为0.006 13±0.001 03,差异具有统计学意义(t=9.708,P＜0.001);过表达FBN1后软骨细胞SOX9、COL2A1、ACAN等软骨相关基因的相对表达量与对照组相比分别增加了1.273±0.071、1.315±0.104、1.928±0.280倍,差异有统计学意义(t=3.874、3.311、3.044,P=0.018、0.001、0.038).结论 猪耳软骨工程化软骨组织中FBN1mRNA表达量及蛋白表达量显著低于正常耳软骨组织;体外实验显示FBN1促进软骨细胞COL2A1、ACAN等软骨相关基因的表达.