左旋丁苯酞对肌萎缩性侧索硬化症细胞损伤的保护作用及其机制

摘要

目的肌萎缩性侧索硬化(ALS)是一种复杂的多因素疾病,其特征在于运动神经元的丢失,是引起慢性运动神经元病的最常见类型,其发病机制尚不明确。由于ALS致死率高,目前上市药物只有利鲁唑和依达拉奉,因此寻找针对ALS的有效治疗药物迫在眉睫。左旋丁苯酞(L-NBP)是从芹菜籽中得到的,后合成消旋体丁苯酞,广泛用于急性缺血性脑卒中的治疗。研究发现,L-NBP具有多种神经保护功能,可以明显抑制氧化应激,减轻神经炎症,改善线粒体功能并减少神经细胞凋亡。鉴于突变TAR DNA结合蛋白43 ku(TDP-43)在ALS病理发展中的重要作用,本研究初步探讨L-NBP对于突变TDP-43所致的ALS相关损伤是否有保护作用及其机制。因而,在体外建立了稳定转染TDP-43 M337V的NSC-34细胞模型,旨在从细胞和分子水平揭示L-NBP对稳定转染TDP-43 M337V的NSC-34细胞内损伤状态的调节作用。方法对L-NBP减轻稳转TDP-43 M337V细胞的损伤机制进行研究,分别测定细胞乳酸脱氢酶(LDH)、活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量;采用彗星实验、免疫荧光、ELISA和Western蛋白印迹法观察L-NBP对细胞损伤的保护作用。结果在建立稳转TDP-43 M337V细胞模型后,分别加入不同浓度的L-NBP。培养24 h后,用CCK-8法检测吸光度值,发现2.5~60μmol·L-1的L-NBP可显著提升细胞的存活率。根据结果选择1,2.5,5和20μmol·L-1浓度的L-NBP进行后续实验。与空载体组相比,稳转TDP-43 M337V造成了细胞内的氧化应激、DNA损伤和蛋白质损伤,L-NBP 20μmol·L-1可显著降低稳转TDP-43 M337V细胞的LDH,ROS和MDA的含量,改善氧化引起的DNA损伤和蛋白质损伤,提升核内NF-E2相关因子2(Nrf2)水平,增加细胞内血红素氧合酶1(HO-1)的含量,但是不能引起稳转TDP-43 M337V细胞的TDP-43和醌氧化还原酶1(NQO1)蛋白水平的显著性改变,且对于泛素-蛋白酶体通路和自噬-溶酶体通路也没有明显影响。结论 L-NBP可浓度依赖性促进稳转TDP-43 M337V细胞的增殖,可能通过激活Nrf2抗氧化通路抑制细胞内氧化应激、降低ROS含量、抑制细胞内脂质和蛋白质过氧化、改善DNA损伤效应,进而发挥其抗ALS的作用。L-NBP在稳转TDP-43 M337V细胞中具有一定的抑制氧化应激的作用,可作为潜在的抗氧化药物用于抗ALS药物的研发中,从而增加L-NBP的新适应症。