rhPGRN通过MAPK/PI3K通路调控自噬和内质网应激并促进细胞增殖

摘要

目的:探讨重组人颗粒体蛋白前体(rhPGRN)对人软骨细胞C28I2和小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖、自噬和内质网应激(ERS)的影响及作用机制.方法:采用Ni-NTA琼脂糖树脂对组氨酸标签蛋白进行特异性亲和纯化,通过考马斯亮蓝染色、BCA法和Western blot验证目的蛋白的浓度和纯度.将细胞随机分为对照组、rhP?GRN组、U0126组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、rhPGRN+U0126、rhPGRN+3-MA、rhPGRN+巴弗洛霉素A1(Baf-A1)和rhPGRN+4-苯基丁酸(4-PBA)组,采用细胞计数法、Western blot和RT-qPCR检测rhPGRN对C28I2和RAW264.7两种不同类型细胞增殖、自噬和ERS的影响.结果:(1)在含有His标签的PGRN稳转细胞株中成功提取高纯度、具有生物活性的人源重组蛋白rhPGRN.(2)rhPGRN能促进C28I2和RAW264.7细胞的增殖,促进细胞周期相关分子(PCNA、cyclin B1和cyclin D1)的mRNA表达(P<0.05),上调细胞周期调控蛋白Ki67表达,并提高增殖相关信号分子ERK和Akt蛋白的磷酸化水平(P<0.05).(3)ERK通路抑制剂U0126抑制了rhPGRN诱导的细胞增殖、自噬和ERS(P<0.05);使用3-MA抑制PI3K/Akt通路后,rhPGRN诱导的细胞自噬被显著抑制(P<0.05);自噬抑制剂Baf-A1和ERS抑制剂4-PBA显著下调了rhPGRN诱导的Ki67蛋白表达(P<0.05).结论:rhPGRN通过MAPK和PI3K/Akt通路调控自噬和ERS,从而促进C28I2和RAW264.7细胞增殖.