脂自噬通过减少巨噬细胞脂质含量抑制泡沫细胞形成

摘要

目的:观察泡沫细胞形成不同时间脂自噬的水平,探讨脂自噬是否参与调节泡沫细胞脂质含量从而抑制泡沫细胞的形成.方法:体外培养THP-1单核细胞,采用佛波酯诱导THP-1单核细胞48 h分化成为巨噬细胞,再用50 mg/L氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导形成泡沫细胞.油红O染色脂质观察泡沫细胞形成,计算脂质含量;采用胆固醇含量测定试剂盒测量泡沫细胞内的总胆固醇(TC)和游离胆固醇(FC)含量,计算胆固醇酯(CE)含量及CE/TC比值;胆固醇外流试剂盒检测泡沫细胞的胆固醇外流率;Western blot检测自噬相关蛋白5(Atg5)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)和P62的表达.荧光染料分别标记脂滴(LD)和LC3抗体,激光共聚焦显微镜检测细胞中LD与LC3的共定位以确定脂自噬水平,再分别采用自噬诱导剂雷帕霉素(Rap)和阻断剂3-甲基腺嘌呤(3MA)干预泡沫细胞,观察细胞内脂自噬水平、胆固醇含量及胆固醇外流的变化.结果:50 mg/L oxLDL作用24 h后细胞内LD大量聚集,CE/TC比值大于50％,泡沫细胞形成.泡沫细胞形成24 h内胆固醇外流率升高,在48 h胆固醇外流率下降(P<0.05).Western blot结果显示,oxLDL作用24 h,Atg5表达及LC3-II/LC3-I比值升高,P62表达降低(P<0.05);在48 h,Atg5和LC3-II/LC3-I均下降,P62表达增加(P<0.05).免疫荧光结果显示,oxLDL作用24 h,LC3与LD共定位水平升高,而在48 h下降(P<0.05).自噬诱导剂Rap上调泡沫细胞Atg5表达,提高LC3II/LC3-I比值,降低P62水平,提高泡沫细胞内LC3与LD的共定位水平(P<0.05),促进胆固醇外流,降低泡沫细胞内TC和CE含量及CE/TC比值(P<0.05);自噬抑制剂3MA作用则相反,可抑制Atg5表达,降低LC3-II/LC3-I比值,同时升高P62的水平,降低LC3与LD的共定位水平(P<0.05),抑制胆固醇外流,增加泡沫细胞内胆固醇的含量(P<0.05).结论:泡沫细胞形成24 h内伴有脂自噬水平的增加,在48 h脂自噬能力减弱,胆固醇外流减少.脂自噬减少泡沫细胞内胆固醇含量,增加胆固醇外流率,参与调节泡沫细胞的脂质含量,从而抑制泡沫细胞的形成.