单个巨噬细胞超氧阴离子水平的定量检测方法

摘要

目的:建立单个巨噬细胞超氧阴离子(O2)水平的定量检测方法,从而达到在单细胞内同时检测O2和细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的目的.方法:分离小鼠腹腔巨噬细胞,用NBT还原法显示细胞产生O2的水平,以细胞加入NBT前与染色后的透光强度之比来定量表示该细胞产生O2的量;以荧光探针Fura-2/AM负载细胞检测单细胞内[Ca2+]i.结果:①分别用PMA、OZ刺激细胞并用NBT还原法染色后细胞内均有黑色沉淀,但前者分布均匀而后者所产生沉淀多偏于一侧,呈明显的局域性分布;②用NBT孵育10 min后,细胞透光强度没有明显变化(n=43,P＞0.05),用NBT刺激细胞产生黑色沉淀后细胞透光强度明显降低(P＜0.01,n=43).③在不同的聚焦状态下,无细胞背景区的透光强度没有明显变化,而细胞区透光强度变化明显,但各个细胞透光强度的变化趋势是一致的;④PMA处理3批巨噬细胞并用NBT法染色得到3组Ro1值的分布情况提示用Ro1值定量是合理的但批间差异过大;⑤静息状态下的小鼠腹腔巨噬细胞[Ca2+]i与细胞受PMA刺激后的Ro1呈显著正相关(n=43,r=0.42,P＜0.01).结论:用NBT还原法染色前后细胞透光强度比值可以代表该细胞产生O2的量,进而我们可以在单细胞内同时检测O2和[Ca2+]i.