基于Cyclin D1基因敲减探讨健骨颗粒促进成骨细胞增殖的机理

摘要

目的验证CyclinD1及其下游信号蛋白对成骨细胞增殖的调控作用,探讨健骨颗粒促进成骨细胞增殖的作用机制。方法培养成骨样细胞株UMR-106,运用CRISPR/Cas9技术敲减CyclinD1基因后,将细胞分为基因敲减+生理盐水组(组1)、基因敲减+健骨颗粒组(组2)、病毒空载体细胞(组3,阴性对照)。未行基因敲减的细胞分为正常细胞+生理盐水组(组4)和正常细胞+健骨颗粒组(组5)。分别用生理盐水血清或健骨颗粒含药血清干预各组细胞24、48、72h,通过CCK8法检测细胞增殖情况,利用RealtimePCR检测CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、Rb及E2F-1基因的表达水平。结果经Western-bolt检测表明基因敲减的成骨细胞CyclinD1蛋白表达明显下降。CCK8法检测结果显示,与组4相比,组5增殖速度变快(P0.05),组1和组2增殖速度均减慢(P0.05)。RealtimePCR检测结果显示,与组4相比,组5CyclinD1、CDK2、CDK4、CyclinE、Rb及E2F-1mRNA的表达明显增高(P0.05),组1和组2表达明显降低(P0.05)。结论CyclinD1及其下游信号蛋白是调控成骨细胞增殖的关键因素;健骨颗粒可以通过调节CyclinD1及其下游信号蛋白促进成骨细胞增殖。