高通量测序筛选与骨肉瘤化疗耐药相关的环状RNA分子表达谱

摘要

目的 通过高通量测序筛选与骨肉瘤化疗耐药相关的环状RNA表达谱,并初步分析、鉴定其可能的分子功能。方法 采用CCK-8实验检测三对配对的耐药和敏感人骨肉瘤细胞系（MG63/DXRvs MG63、U2OS/DXRvs U2OS、KHOS/DXRvs KHOS）对于三种常用骨肉瘤化疗药物（多柔比星、顺铂、甲氨蝶呤）的敏感性。后采用下一代高通量RNA测序技术,在三对配对的化疗多药耐药和敏感的人骨肉瘤细胞系中进行circRNA表达谱的比较分析。使用实时定量PCR（qRT-PCR）在化疗耐药骨肉瘤细胞系和组织中确认测序数据的可靠性和准确性。此外,还进行包括GO、KEGG通路分析和circRNA-miRNA网络构建在内的多种生物信息学分析,以预测差异表达的circRNA的潜在分子功能,构建相关的可能调控通路或网络。结果 三种骨肉瘤耐药细胞（MG63/DXR、U2OS/DXR、KHOS/DXR）对于三种常见的骨肉瘤化疗药物均较对照组细胞（MG63、U2OS、KHOS）具有明显的抵抗性；RNA测序共检测到80个组间差异表达的circRNAs,相对于药物敏感的骨肉瘤细胞,药物抵抗骨肉瘤细胞系中,57个circRNAs表达上调,23个circRNAs表达下调（组间差异倍数≥2或≤0.5）。随机选择其中的10个circRNA行qRT-PCR验证,发现有9个qRT-PCR的检测结果与测序结果一致；此外,KEGG通路分析结果显示56个通路在差异表达的circRNAs中被显著富集,包括糖酵解/糖异生、ABC转运蛋白、VEGF信号通路等等。此外,发现在化疗耐药的骨肉瘤细胞和组织中,上调倍数最高的circRNA-hsacirc0004674明显高表达,与骨肉瘤患者的预后不良有关。通过权威数据库（TargetScan和miRanda）和文献搜索,构建了与hsacirc0004674相关的一些潜在的内源竞争性RNA（ceRNA）调控通路,例如hsacirc0004674-miR-490-3p-ABCC2和hsacirc0004674-miR-1254-EGFR等,并预测了与hsacirc0004674存在潜在ceRNA调控关系的miRNA之间的miRNA反应元件序列。结论 CircRNA与肿瘤的进展密切相关,可能在骨肉瘤化疗耐药中发挥作用,而hsacirc0004674可能是逆转耐药性的潜在候选靶点。