CRL4B复合物抑制分泌型卷曲相关蛋白1促进胰腺癌的发生发展

摘要

目的探讨CRL4B复合物在胰腺癌发生发展中的作用及其分子机制。方法将胰腺癌细胞分为对照组（转染阴性对照慢病毒）、shCUL4B组（转染CUL4B慢病毒）、shDDB1组[转染DNA损伤结合蛋白1（DDB1）慢病毒]和shCUL4B+siSFRP1组[转染CUL4B慢病毒+分泌型卷曲相关蛋白1（SFRP1）-siRNA]。对敲低CUL4B和DDB1的胰腺癌细胞系进行RNA测序（RNA-seq）, 寻找CRL4B复合物调控的靶基因, 采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测靶基因mRNA的表达, 染色质免疫共沉淀（ChIP）-PCR实验鉴定CRL4B复合物直接调控的靶基因, Western blot法检测上皮-间充质转化（EMT）标志物蛋白的表达水平, EdU细胞增殖实验检测细胞增殖能力, 划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。采用GEO、TCGA和GTEx数据库中胰腺癌相关肿瘤样本和正常组织样本的测序数据, 分析CUL4B、DDB1和其下游靶基因的表达相关性。结果 RNA-seq结果显示, CRL4B复合物调控的靶基因涉及多种恶性肿瘤相关信号通路。qRT-PCR检测结果显示, shCUL4B和shDDB1组待验证靶基因的mRNA表达水平均高于对照组, 差异有统计学意义（均P＆0.05）。ChIP-PCR实验结果显示, CRL4B复合物直接结合在NME1和SFRP1靶基因启动子区, 敲低CUL4B的表达后, 靶基因启动子区域组蛋白H2A第119位赖氨酸单泛素化富集减少。对照组PANC-1细胞增殖率为（32.10±3.58）%, 高于shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为（13.95±1.66）%和（22.38±0.77）%, 均P＆0.05];对照组AsPC-1细胞增殖率为（35.47±7.80）%, 高于shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为（19.60±3.58）%和（30.09±0.81）%, 均P＆0.05]。细胞划痕实验显示, 对照组PANC-1细胞迁移率为（53.18±3.70）%, 高于shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为（17.46±2.62）%和（44.99±9.18）%, 均P＆0.05]。Western blot结果显示, 对照组细胞上皮标志物α-catenin和γ-catenin的表达分别为1.00±0.03和1.01±0.11), 低于shCUL4B组（分别为1.44±0.01和1.21±0.06, 均P＆0.05）, 对照组细胞间充质标志物Fibronectin和Vimentin表达水平分别为1.01±0.14和1.02±0.18, 高于shCUL4B+siSFRP1组（分别为1.53±0.13和1.22±0.07, 均P＆0.05）。对照组细胞的迁移率为（100.00±3.96）%, 与shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为（35.49±0.34）%和（107.06±2.77）%]比较, 差异均有统计学意义（均P＆0.05）。CUL4B和DDB1在胰腺癌中表达升高, 且与SFRP1的表达呈负相关（r分别为-0.342和-0.264）。结论胰腺癌中CRL4B复合物转录抑制靶基因SFRP1进而促进胰腺癌的发生发展, 且CRL4B复合物在胰腺癌中的高表达支持了其作为胰腺癌治疗的潜在靶点。