PHF1是一种新型组蛋白精氨酸甲基化识别蛋白并与PRMT5/CRL4B复合物协同促进乳腺癌发生和转移

摘要

组蛋白翻译后修饰是表观遗传调控的一种重要方式，通过作用于蛋白DNA亲和力进而影响基因转录、DNA复制、DNA损伤修复等多个细胞进程。组蛋白修饰能够调节染色质结构，而其发挥作用的主要方式是通过与具有组蛋白识别结构域的效应蛋白结合，我们称这些蛋白质为组蛋白识别蛋白。这一类具有识别功能的结构域越来越多的被人们所认识和发现，比如PHD结构域、TUDOR结构域、WD40结构域、Chromo结构域等。组蛋白密码通过其识别蛋白被识别和解读，进而向其下游传递信息而产生效应。PHF1就是一个已发现的组蛋白识别蛋白，它能够解读组蛋白翻译后修饰的信息，并借此参与到基因转录调控过程中。PHF1具有一个TUDOR结构域和两个PHD锌指结构域，这些识别结构域使其在表观遗传调控和维持基因组稳定性中发挥重要的作用。研究表明，PHF1与PRC2复合物之间存在相互结合，能够影响EZH2的甲基转移酶活性，对组蛋白H3K27的甲基化水平和HOX基因的转录抑制产生影响。另外，PHF1的TUDOR结构域能够识别H3K36me3和H3tK27me3，证明了其组蛋白识别蛋白的功能，然而其另外两个PHD锌指结构域的作用仍然不明确。
　　在本研究中，我们发现PHF1能够通过其N端的PHD锌指结构域识别PRMT5-WDR77所催化的对称性二甲基化H4R3位点。而PHF1的C端PHD结构域能够结合DDB1蛋白，它是H2AK119ub1的催化酶复合物CRL4B的重要组成部分。我们证明了PHF1、PRMT5-WDR77和CRL4B之间互相结合并作为一个有机整体发挥作用，实现H4R3me2s-H2AK119ub1这一协同转录抑制标志在染色质上的蔓延。PHF1/PRMT5/CUL4B的靶基因分析表明他们能共同调控包括E-cadherin和FBXW7在内的多个基因的表达。我们证实了PHF1在体内和体外都能促进肿瘤细胞的增殖和转移，并发现其表达水平在多种人类肿瘤组织中明显上调。
　　为了寻找PHF1在体内所能结合的其他蛋白质，我们首先将稳定表达FLAG-PHF1的质粒转染HEK293T细胞系，通过免疫亲和纯化联合银染质谱分析的方法鉴定出了一些PHF1可能结合的蛋白。之后我们通过免疫共沉淀（co-IP）的方法发现PHF1与多种转录调控复合物之间存在相互作用。我们发现其中的PRMT5/WDR77和CRL4B复合物之间也存在结合，这也提示我们这三者之间可能结合为一个整体发挥作用。我们通过GST pulldown实验对三者之间的直接作用方式进行了分析，并通过一系列的截短载体进一步研究了参与其结合的结构域。考虑到PHF1的识别蛋白功能，我们用GST pulldown的方法尝试了几种组蛋白修饰发现PHF1可能会识别H4R3me2s修饰。进一步研究发现，PHF1的PHD结构域在这一识别过程中发挥作用。
　　为了探明PHF1/PRMT5-WDR77/CRL4B复合物在转录调控中的作用，我们通过ChIP-on-chip技术寻找其共同调控的靶基因，并通过qChIP方法进行验证。干扰PHF1、PRMT5和CUL4B的表达后，E-cadherin和FBXW7基因的表达水平出现增高。通过ChIP/Re-ChIP方法发现PHF1、PRMT5-WDR77-H4R3me2s和CRL4B-H2AK119me1共同结合于E-cadherin和FBXW7基因的启动子上，并且每个组分都具有重要的作用，提示PHF1、PRMT5-WDR77-H4R3me2s和CRL4B-H2AK119me1可能作为一个有机整体协同发挥作用，缺一不可。
　　关于PHF1在肿瘤中的作用尚不明确，我们通过生长曲线、平板克隆和EDU等实验发现PHF1能够促进乳腺癌细胞的增殖。通过EMT标志物的表达检测和转移小室实验发现PHF1能够促进乳腺癌细胞的转移。NOD-SCID小鼠原位或尾静脉注射乳腺癌细胞，通过小动物活体成像系统检测发现PHF1能够促进肿瘤细胞在体内的增殖和转移。我们利用乳腺癌病人标本的免疫组化染色发现PHF1在乳腺癌组织中表达上调，并且其表达水平随肿瘤组织的恶性程度而升高。其他肿瘤组织样本的组化分析表明PHF1在多种肿瘤组织中表达异常升高。生物信息学分析也显示PHF1在肿瘤组织中表达上调，并且与肿瘤病人预后不良相关。
　　综上所述，我们发现PHF1是一类新型的组蛋白精氨酸甲基化识别蛋白，并能与PRMT5-WDR77和CRL4B形成复合体，共同参与如E-cadherin和FBXW7等靶基因的转录调控，进而促进乳腺癌细胞的增殖和转移。我们的发现也为组蛋白精氨酸甲基化和组蛋白泛素化的协同作用提供了分子基础。该项研究探明了PHF1在肿瘤进程中作用，提示PHF1可能为肿瘤尤其是乳腺癌临床诊断、检测和治疗的新靶点。

目录

声明

符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、PHF1识别H4R3对称性二甲基化，并与PRMT5/WDR77和CRL4B复合物相互结合为有机整体

1. 材料与方法

2. 结 果

3. 讨 论

4. 小 结

二、PHF1、PRMT5/WDR77和CRL4B复合物协同调控E-cadherin和FBXW7基因的表达

1. 材料与方法

2. 结 果

3. 讨 论

4. 小 结

三、PHF1促进乳腺癌细胞的增殖和转移并在多种肿瘤细胞中表达异常增高

1. 材料与方法

2. 结 果

3. 讨 论

4. 小 结

全文结论

1. PHF1识别H4R3对称性二甲基化，并与PRMT5/WDR77和CRL4B复合物相互结合为有机整体

2. PHF1、PRMT5/WDR77和CRL4B复合物协同调控E-cadherin和FBXW7基因的表达

3. PHF1促进乳腺癌细胞的增殖和转移并在多种肿瘤细胞中表达异常增高

论文创新点

1. 首次发现PHF1是组蛋白精氨酸甲基化识别蛋白

2. 首次发现PHF1与多种转录调控复合物结合

3. 首次发现PHF1、PRMT5/WDR77和CRL4B复合物能够形成一个有机整体参与转录调控，形成了一个新的转录调控模型

4. 首次发现PHF1促进乳腺癌细胞的增殖和转移

5. 首次发现PHF1在乳腺癌和多种肿瘤组织中表达异常增高

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:上皮间质转化与肿瘤

致谢

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