乳腺癌耐药细胞来源的Exosomes的分离鉴定及其在耐药传递中的作用

摘要

目的探讨乳腺癌多西紫杉醇（DOC）耐药细胞（MCF-7/DOC）和阿霉素（ADM）耐药细胞（MCF-7/ADM）对Exosomes的分泌功能及其在耐药性传递中的作用。方法采用超速分级离心的方法,从乳腺癌耐药细胞培养液上清中提取Exosomes,透射电镜下观察其形态特征,Western blot法检测乳腺癌耐药细胞和Exosomes中标志蛋白的表达情况。利用重组慢病毒载体构建稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的乳腺癌亲本敏感细胞系GFP-MCF-7/S,通过细胞间耐药实验和Exosomes传递耐药性实验观察耐药性传递现象。结果与MCF-7/S细胞相同,MCF-7/DOC和MCF-7/ADM细胞也分泌Exosomes,均为圆形或椭圆形的膜性囊泡,直径为30~100 nm。Exosomes仅表达Exosomes标志性蛋白Tsg101,不表达内质网标志蛋白Calnexin。MCF-7/S、MCF-7/DOC或MCF-7/ADM细胞与GFP-MCF-7/S细胞共培养72 h后,荧光显微镜下观察各组细胞的荧光表达情况无明显差别。但在加入化疗药物DOC或ADM处理24 h后,MCF-7/DOC+GFP-MCF-7/S组细胞的荧光细胞平均存活率为65.5%,明显高于MCF-7/S+GFP-MCF-7/S组细胞（25.5%,P＜0.001）;MCF-7/ADM+GFP-MCF-7/S组细胞的荧光细胞平均存活率为53.6%,亦明显高于MCF-7/S+GFP-MCF-7/S组细胞（25.4%,P＜0.001）。MCF-7/S、MCF-7/DOC或MCF-7/ADM细胞来源的Exosomes与GFP-MCF-7/S细胞共培养48 h后,荧光显微镜下观察各组细胞的荧光表达情况无明显差别。但在加入化疗药物DOC或ADM处理24 h后,MCF-7/DOC来源的Exosomes+GFP-MCF-7/S组细胞的荧光细胞平均存活率为59.9%,明显高于MCF-7/S来源的Exosomes+GFP-MCF-7/S组细胞（32.4%,P＜0.001）;MCF-7/ADM来源的Exosomes+GFP-MCF-7/S组细胞的荧光细胞平均存活率为58.3%,亦明显高于MCF-7/S来源的Exosomes+GFPMCF-7/S组细胞（27.2%,P＜0.001）。结论乳腺癌细胞间存在着耐药性传递的现象,Exosomes可能是耐药信息传递的转运载体。