富里酸干预缺氧诱导人视网膜微血管内皮细胞基因表达谱的MiSeq测序分析

摘要

目的观察富里酸（FA）干预缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）基因表达谱的MiSeq测序分析结果。方法体外培养hRMEC, 并将其分为缺氧组（缺氧处理）和FA干预组（即缺氧后FA干预）。采用MTT比色法检测不同浓度和不同作用方式的FA对hRMEC活性的影响。选择FA的最佳作用浓度, 通过实时荧光定量PCR （RT-PCR）验证FA对缺氧诱导hRMEC中细胞间黏附分子-1 （ICAM-1）、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、MMP-2、TNF-α、TNF-β等炎症因子及炎症相关因子mRNA表达的影响。收集处于对数生长期的缺氧组和FA干预组细胞, 应用MiSeq测序技术对两组细胞进行全转录组测序, 获得生物学大数据, 在此基础上分析差异表达的miRNA;通过基因注释（GO）功能显著性富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路显著性富集分析对差异miRNA的功能及信号通路进行分析。组间炎症因子及炎症相关因子表达比较时, 通过miRNA mimic调节细胞中相应miRNA的表达水平, 观察其对细胞功能的影响, 从而判断该miRNA的作用。结果不同浓度和不同作用方式的FA对hRMEC的细胞活性无影响。RT-PCT检测结果显示, 缺氧组hRMEC中ICAM-1、IL-1β、IL-6和TNF-β的mRNA表达较正常组明显上调, 差异有统计学意义（t=3.426、6.011、5.282、6.500 , P=0.027、0.004、0.006、0.003）;FA干预组hRMEC中ICAM-1、IL-6、TNF-α和TNF-β的mRNA表达较缺氧组明显下降, 差异有统计学意义（t=9.961、3.676、3.613、3.387, P=0.001、0.021、0.023、0.028 ）。缺氧组和FA干预组之间共有14个差异表达miRNA, 其中上调基因9个, 下调基因5个。共4个差异miRNA （hsa-miR-1 285-3p、hsa-miR-30d-3p、hsa-miR-3 170、hsa-miR-7 976）的预测靶基因均为ICAM-1。GO功能显著性富集分析结果显示, 差异基因的功能主要富集在细胞发育、细胞分化和单生物发育过程中。KEGG通路显著性富集分析结果显示, 差异miRNA表达高度富集的是癌症中蛋白多糖通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路, 差异表达较明显的是花生四烯酸代谢通路和安非他明成瘾性通路。结论 FA可能通过调控多个miRNA的表达, 影响下游ICAM-1 mRNA的表达水平, 从而对缺氧刺激hRMEC后细胞的炎性状态产生影响。