慢病毒载体介导色素上皮衍生因子基因转染人脐带间充质干细胞研究

摘要

目的构建携带色素上皮衍生因子（PEDF）基因的慢病毒（LV）载体并转染人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）,初步探讨基因修饰PEDF-间充质干细胞的可行性。方法采用基因重组方法构建LVPEDF载体,测定其LV滴度,以感染复数（MOI）值为10、30、50的LV体外转染hUCMSCs,并据此分为相应MOI值实验组;以不含PEDF基因的相同MOI值的重组LV载体[LV-绿色荧光蛋白（GFP）]转染hUCMSCs,并据此分为相应MOI值对照组。荧光显微镜观察两组细胞转染效率并计算转染率。采用细胞免疫荧光法、免疫细胞化学法、实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测50MOI实验组、50MOI对照组细胞中PEDF、血管内皮生长因子（VEGF）表达水平。结果经酶切以及基因测序鉴定证明LV载体构建成功。转染96 h后,50MOI实验组细胞可见大量GFP表达,转染效率为72.1%。荧光显微镜观察发现,转染后96 h,50MOI实验组细胞胞浆PEDF、VEGF表达增强。光学显微镜观察发现,转染后96 h,50MOI实验组细胞胞浆PEDF表达较低,而VEGF表达较强。RT-PCR检测结果发现,50MOI实验组、50MOI对照组细胞中PEDFmRNA相对表达量分别为0.170±0.028、0.015±0.007;VEGFmRNA相对表达量分别为0.265±0.022、0.285±0.049。两组细胞中PEDF mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义（F=70.29,P＜0.001）;VEGF mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义（F=9.57,P＞0.05）。结论成功构建携带PEDF基因LV表达载体,并在hUCMSCs中过表达PEDF基因。