PTEN基因亚克隆和pTRE-PTEN反应质粒构建

摘要

目的亚克隆野生型与张力蛋白在10号染色体同源缺失的磷酸酶(PTEN)基因,构建四环素反应性元件调控的与张力蛋白在10号染色体同源缺失的磷酸酶反应质粒(pTRE-PTEN).方法以pBP-PTEN质粒为模板, 应用pfuDNA聚合酶,多聚酶链反应法(PCR)扩增PTENcDNA.将扩增的PTENcDNA与三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,然后将产物与pGEM-T-Easy载体直接连接;连接产物转化大肠杆菌DH5 α,蓝白筛选,挑选白色克隆作鉴定测序.将测序正确的pGEM-T-Easy/PTEN和带潮霉素筛选标记的四环素反应性元件质粒(pTRE2Hyg)分别双酶切,前者回收1.2 kb的PTEN片段,后者回收线性化的pTRE2Hyg片段,将两者连接成pTRE-PTEN表达重组体,转化大肠杆菌DH5α,抽提重组体质粒,经NotⅠ和SalⅠ酶切鉴定阳性克隆含有大小约6.4 kb和1.2 kb的两条带.结果成功地从pBP-PTEN质粒中亚克隆人PTENcDNA,并构建了pTRE-PTEN反应质粒.结论 pTRE-PTEN反应质粒的构建为建立pTet-on-PTEN-U87MG细胞系奠定基础.