C99引导淀粉样蛋白前体裂解过程的活体细胞研究

摘要

目的构建含有Swedish突变和Flemish突变的荧光真核表达系统,研究淀粉样蛋白前体（APP）酶解过程。方法通过聚合酶链式反应（PCR）得到编码Flemish突变的APP最后300个碱基片段（C99）、蓝色荧光蛋白（CFP）、黄色荧光蛋白碱基序列（YFP）,生物合成含有Swedish突变的APP中间54个碱基片段（54bp）,利用基因工程技术将CFP、54bp、YFP、C99片段克隆至载体质粒pcDNA3.0中,通过酶切、PCR、测序鉴定最终得到重组质粒pcDNA3.0-CFP-54 bp-YFP-C99,并将其转染至人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）中,利用激光共聚焦显微镜观察荧光表达;检测荧光共振能量转移（FRET）,以及进行β淀粉样蛋白（Aβ）免疫细胞化学染色。结果（1）基因序列分析证明重组质粒构建成功。（2）利用激光共聚焦显微镜观察转染细胞,发现融合基因能够准确表达蓝色和黄色荧光。（3）FRET检测发现CFP-54bp-YFP-C99可以发生β和γ裂解产生Aβ,沉积在细胞内、胞膜上以及细胞间隙;CFP-54bp-YFP不能发生β裂解。（4）免疫细胞化学染色证实Aβ在细胞膜、胞浆内以及细胞间隙聚集沉积。结论（1）重组质粒能够完成APP的有序裂解产生Aβ。（2）成功实现在活体细胞中观察APP裂解。（3）Aβ有可能产生于APP由胞浆至胞膜的运输过程中。（4）C99对于APP被裂解有重要意义,可能起到信号肽样的引导定位作用。