GFAP特异性启动IκBα突变型基因真核表达载体的构建和鉴定

摘要

目的 构建GFAP特异性启动的、能稳定表达IκBα突变型基因的真核表达载体.方法 用基因工程的方法将潮霉素抗性基因和GFAP特异性启动的IκBα突变型基因定向克隆入载体pBluescript-SK中, 酶切反应鉴定重组载体SK-hyg和SK-hyg-GFAP/IκBαM .用脂质体法分别将载体SK-hyg和SK-hyg-GFAP/IκBαM转入永生化星形胶质细胞株和PC12细胞株中, 经潮霉素(150 μg/mL)筛选, 挑选阳性克隆并扩大培养, Western blot检测阳性细胞株中IκBα的表达, 以 NF-κB特异性启动表达的荧光素酶报告基因检测细胞中NF-κB的活性.结果 限制性酶切分析证实重组载体成功, 稳定转染SK-hyg和SK-hyg-GFAP/IκBαM的PC12细胞内IκBα蛋白质表达及细胞中NF-κB活性无差异, 稳定转染SK-hyg-GFAP/IκBαM 的永生化星形胶质细胞内有突变型IκBα的蛋白质表达, 而转染SK-hyg的永生化星形胶质细胞内则没有, 且前者细胞内NF-κB活性下降.结论 GFAP特异性启动的、能稳定表达IκBα突变型基因的真核表达载体构建成功.