肺炎链球菌StkP/CiaR组成耐药相关二元信号传导系统的分析与鉴定

摘要

目的确定肺炎链球菌β-内酰胺抗生素耐药相关胞内应答调节蛋白CiaR能与跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶StkP结合组成StkP/CiaR二元信号传导系统（TCSS）。方法采用PCR扩增stkP基因胞内区片段（IC-stkP）,T-A克隆测序确认序列正确后构建其原核表达系统。SDS-PAGE检查IC-stkP片段和我们以往构建的ciaR基因原核表达系统目的重组蛋白rIC-StkP和rCiaR表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rIC-StkP和rCiaR。采用Co-IP和LC-MS/MS鉴定rIC-StkP捕获的肺炎链球菌靶蛋白。采用等离子共振法（SPR）和等温滴定量热法（ITC）检测rCiaR与rIC-StkP结合能力。结果所构建的IC-stkP片段原核表达系统能有效表达rIC-StkP。SDS-PAGE结果显示提纯的rIC-StkP和rCiaR在胶上均为单一蛋白质条带。CiaR可与rIC-StkP特异性共沉淀,其3个裂解肽位于CiaR分子内且序列完全相符。SPR和ITC结果显示,rCiaR与rIC-StkP呈高亲和力强结合,其KD值分别为1.526×10-9 mol/L和1.980×10-6 mol/L。结论肺炎链球菌CiaR可作为StkP激酶下游应答调节蛋白组成StkP/CiaR-TCSS。