SYBR greenⅠRQ-PCR定量检测DNA方法的改良与建立

摘要

目的探讨用改良SYBR greenⅠ实时定量PCR(RQ-PCR)技术消除引物二聚体(PDs)对定量分析的影响,建立准确的定量检测DNA含量的方法.方法以β-actin 为目的基因,通过对扩增产物和PDs熔解曲线的分析找出各自的解链温度(Tm),选择在高于PDs Tm但低于目的片段 Tm的温度时检测荧光信号,建立改良SYBR greenⅠRQ-PCR方法.结果该法可消除PDs对SYBR greenⅠRQ-PCR的影响.用此法构建所得标准曲线斜率为-3.178 866,相关系数为-0.980 535,PCR反应动力学范围达5个log值(102～106);精确性检测中,DNA含量实测值与预测值的差异无统计学意义(P>0.05);稳定性检测中,3种不同浓度标本的批内变异和批间变异分别为1%、3%、2%和2%、4%、4%.结论改良SYBR greenⅠRQ-PCR可有效消除PDs对定量分析的影响,对目的基因DNA拷贝数进行PCR反应线性范围广、敏感性、精确性和稳定性好的定量检测.是一种简便实用的DNA定量检测的方法.