产毒型霍乱弧菌实时定量三重TaqMan PCR快速检测方法的建立

摘要

目的研究建立可同时检测产毒型O1群及O139群霍乱弧菌的实时荧光三重TaqManPCR快速检测方法。方法根据O1群和O139群霍乱弧菌主基因组O抗原编码基因的特异性序列rfb-O1和rfb-O139,以及霍乱弧菌肠毒素A亚基的编码基因ctxA序列设计引物及探针,利用TaqMan标记探针和便携式SmartcyclerⅡ实时荧光PCR检测平台探讨该三重检测方法的检测敏感性,并用19种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌评价了该检测方法的特异性。结果实时荧光三重TaqMan PCR快速检测方法对O1群及O139群霍乱弧菌的检测灵敏度均为每反应体系1.0×10~2拷贝,线性检测范围为每反应体系1.0×10~2～1.0×10~9拷贝;对O1群霍乱弧菌基因组DNA的检测灵敏度为每反应体系1.0×10-1pg,对O139群霍乱弧菌基因组DNA的检测灵敏度为每反应1 pg,该检测体系在检测19种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌时不存在非特异性扩增;整个反应在2 h内完成。结论本研究建立的实时荧光三重TaqMan PCR检测方法可作为鉴别产毒型O1群及O139群霍乱弧菌特异、敏感、快速的检测手段,也可同时检测相应霍乱弧菌产生霍乱毒素的能力。