基于Klotho/FGF23轴探讨益气活血通络方对高磷诱导血管平滑肌细胞钙化的影响

摘要

目的:基于Klotho/成纤维细胞生长因子23(FGF23)轴探讨益气活血通络方对高磷诱导血管平滑肌细胞钙化的影响。方法:制备益气活血通络方含药大鼠血清,并提取和培养原代大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)。采用β-甘油磷酸(β-GP)诱导大鼠VSMCs钙化模型,加入不同浓度的益气活血通络方含药大鼠血清进行干预,实验设置8组:对照组、模型组、益气活血通络方低剂量组(模型+10%含药血清)、益气活血通络方高剂量组(模型+20%含药血清)、益气活血通络方+sh-Klotho组(模型+20%含药血清+sh-Klotho)、益气活血通络方+阴性对照质粒(sh-NC)组(模型+20%含药血清+sh-NC)、益气活血通络方+成纤维细胞生长因子23基因过表达腺病毒(Ad-FGF23)组(模型+20%含药血清+Ad-FGF23)、益气活血通络方+重组腺病毒空载体(AdLaz)组(模型+20%含药血清+AdLaz)。显微镜下观察VSMCs的形态学变化并采用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色鉴定大鼠VSMCs;细胞计数(CCK-8)法检测细胞增殖情况;茜素红S染色观察钙结节的形成情况;按照钙离子(Ca^(2+))浓度及碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒检测细胞内Ca^(2+)浓度、ALP活性;实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细胞Klotho、FGF23、α-SMA、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨形态发生蛋白-2(BMP2)的mRNA和蛋白表达。结果:与对照组比较,模型组可见橘红色钙化结节明显增多,钙化结节面积、Ca^(2+)浓度和ALP活性以及FGF23、RUNX2、BMP2的mRNA和蛋白表达明显增加(P<0.05),Klotho、α-SMA的mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,益气活血通络方低、高剂量组钙化结节明显减少,钙化结节面积、Ca^(2+)浓度和ALP活性以及FGF23、RUNX2、BMP2的mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05),Klotho、α-SMA的mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05);而沉默Klotho或上调FGF23的表达能明显逆转益气活血通络方对VSMCs钙化的作用。结论:益气活血通络方可抑制高磷环境中VSMCs向成骨表型分化,减轻VSMCs的钙化;其作用机制可能与激活Klotho/FGF23轴有关。