百草枯诱导PC12细胞MicroRNA的变化及bcl-2调控机制

摘要

目的探讨百草枯（paraquat,PQ）诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）细胞毒性中MicroRNA（miRNA）的表达及bcl-2的调控机制。方法以PC12细胞为多巴胺能神经元的细胞模型,用终浓度为0、62.5μmol/LPQ分别诱导PC12细胞24 h,用微列阵芯片技术筛选变化显著的miRNA,实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（realtimePCR）进行验证;根据microRNA数据库（TargetScan 5.1）提供的靶标预测分析结果,搜寻其相关的靶标;用终浓度为0、62.5、125.0、250.0、500.0、1000.0μmol/LPQ染毒细胞24 h,Annexin V-FITC/PI法流式细胞仪测定细胞凋亡,RT-PCR测定miR-34a、miR-Let-7e的相对表达水平,免疫印迹法（Western blot）测定bcl-2蛋白表达水平。结果与对照组比较,125.0、250.0、500.0、1000.0μmol/LPQ染毒PC12细胞24h后,细胞存活率明显降低,细胞凋亡率明显上升,差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）,且呈现剂量依赖性。基因芯片技术显示,62.5μmol/L PQ作用于PC12细胞24 h引起8个miRNA表达下调,11个miRNA表达上调;其中miR-34a上调、miR-Let-7e下调最为明显。RT-PCR显示,随着PQ浓度的增加,miR-Let-7e表达水平持续下降,miR-34a表达水平持续上升,与芯片结果一致;随着PQ染毒剂量增加,bcl-2蛋白表达水平明显降低,且与miR-34a的表达量呈剂量-反应关系。结论 miRNAs的异常表达参与了PQ致PC12细胞损伤过程。PQ可能通过上调miR-34a表达增加bcl-2蛋白表达,进而诱导PC12细胞凋亡。