6种常见呼吸道感染细菌16s rRNA基因的克隆与鉴定

摘要

目的:克隆并鉴定6种常见呼吸道感染细菌16s rRNA基因,为制备基因芯片探针做准备.方法:设计、合成6种细菌16s rRNA基因扩增引物;PCR扩增16s rRNA基因目的片段;克隆16s rRNA基因片段;最后对重组质粒进行鉴定.结果:(1)6种细菌16s rRNA基因片段的PCR扩增结果:大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌在1 300 bp处出现特异的目的片段;铜绿假单胞菌在1 100 bp出现特异的目的片段,与预计的片段大小吻合.(2)PCR产物分别与pMD18-T载体连接并转化JM109受体菌之后在Ampr培养基表面生长,其中蓝色菌落为阴性克隆,白色菌落是阳性克隆.(3)各克隆质粒PCR鉴定及双酶切鉴定,结果均可见特异目的带.(4)克隆质粒的序列分析示:6种细菌克隆质粒部分16s rRNA基因序列与GenBank中发表序列同源性为99.8%以上,说明细菌16s rRNA基因已克隆成功.结论:成功克隆了大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌及铜绿假单胞菌16s rRNA基因片段,为制备基因芯片探针奠定了基础.