抗凝血酶L99氨基酸位点突变对其功能的影响

摘要

目的研究抗凝血酶（AT）L99氨基酸位点突变导致遗传性AT缺陷症的分子机制。方法利用果蝇细胞表达系统表达纯化野生型AT以及L99V、L99A、L99I和L99S等突变型AT蛋白;采用肝素结合实验检测重组AT蛋白与低分子量肝素钠的结合能力;采用表面等离子共振（SPR）技术检测重组AT蛋白与凝血酶（FⅡa）及活化凝血因子X（FXa）的结合能力;将野生型及各突变型AT蛋白的浓度调整至正常AT血浆浓度后,采用发色底物法检测重组AT蛋白活性。结果考马斯亮蓝染色及免疫印迹法显示各突变蛋白与野生型AT蛋白大小一致,未见明显杂带。肝素结合实验显示ATL99V、L99A、L99I和L99S突变蛋白与低分子量肝素钠的结合分别为相同浓度野生型AT蛋白的（44.8±3.6）%、（118.9±14.0）%、（15.2±8.8）%和（23.0±8.2）%。SPR检测显示ATL99V、L99A、L99I和L99S突变蛋白与FⅡa的结合分别为相同浓度野生型AT蛋白的13%、57%、3%和29%;ATL99V、L99A、L99I和L99S突变蛋白与FXa的结合分别为相同浓度野生型AT蛋白的7%、51%、1%和25%。发色底物法显示,野生型AT蛋白及L99V、L99A、L99I、L99S等突变型AT蛋白活性分别为146.5%、21.4%、120.9%、10.8%和39.0%。结论 L99位点突变破坏了AT与肝素、FⅡa及FXa的结合,使AT蛋白活性下降,从而导致遗传性AT缺陷症。