人分泌型Klotho蛋白在CHO细胞中的稳定表达

摘要

目的 在CHO细胞中稳定表达人分泌型Klotho(hsKL)蛋白,制备具有天然结构的重组hsKL(rhsKL)蛋白.方法 用PCR法自克隆载体pBS-hakl中克隆hsKLDNA,构建真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)-hskl.经核酸测序确证后,阳离子聚合物转染CHO细胞.用PCR法筛选具有Zeocin抗性的阳性细胞克隆,SDS-PAGE(银染色)法确定CHO细胞分泌蛋白的分子量,Western印记法鉴定CHO细胞的培养上清液中的rhsKL蛋白,确定稳定转染细胞株CHO-hsKL.结果 经PCR法克隆的序列与Gene Bank登录的hskl mRNA序列一致.将hsKL DNA定向插入pcDNA3.1/Zeo(+),构建pcDNA3.1/Zeo(+)-hskl真核表达载体并通过阳离子聚合物转染CHO细胞获得Zeocin抗性的转染阳性克隆.SDS-PAGE和Western blot分析显示,转染的CHO培养上清中含有分子量约为66kDa的rhsKL蛋白.结论 首次实现天然结构的hsKL蛋白的重组表达--获得稳定表达细胞株CHO-hsKL.