应用抑制性消减杂交技术筛选NS5ATP5的上调基因

摘要

目的通过抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5A反式激活蛋白5(NS5ATP5)的反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库,筛选HCVNS5ATP5蛋白反式激活靶基因.方法以HCV NS5ATP5表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.结果成功构建人HCVNS5ATP5蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到91个白色克隆,进行菌落PCR分析,其中86个均得到100～1 000 bp插入片段.挑取32个插入片段测序分析.其中包括结缔组织生长因子、纤维连接蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白l等重要的基因.结论成功筛选出HCV NS5ATP5的上调基因.