外源性胃泌素在胃癌细胞增殖和凋亡中的作用

摘要

@@我们应用MKN45胃癌细胞株通过四唑蓝(MTT)比色分析法及流式细胞仪观察胃泌素在细胞增殖、凋亡中的作用，同时观察丙谷胺对胃泌素的拮抗作用，并与5-氟尿嘧啶(5-Fu)作比较，结果报道如下。rn　　一、材料与方法rn　　1.细胞培养：MKN45胃癌细胞株(上海市消化疾病研究所提供)培养于RPMI　1640培养液中，加入体积分数为10%小牛血清，置37 ℃5%CO2恒温培养箱，隔天换液，3 d传代。rn　　2.试剂配制及实验分组：用5%的小牛血清的1640液将胃泌素(上海丽珠东风生物技术公司)配为25　mg/L浓度，丙谷胺(江苏金坛制药厂)浓度为32　mg/L，5-Fu浓度为10　mg/L。实验共分5组：空白对照组、胃泌素组、丙谷胺组、胃泌素＋丙谷胺组和5-Fu组。rn　　3.MTT比色分析法：取传代后72　h的细胞，用含10%小牛血清的培养液调整细胞浓度为1× 108个/L，接种于96孔培养板，每孔100　μl，待细胞贴壁后弃去培养液，空白对照组加5 %小牛血清培养液100　μl，胃泌素组加胃泌素液100　μl，丙谷胺组加丙谷胺液100　μl ，胃泌素＋丙谷胺组二者各加50　μl。5-Fu组加5-Fu液100　μl，每组设8个复孔，培养72　h，结束培养前6　h加质量分数为5%MTT(Sigma公司)20　μl/孔，继续培养6　h,离心，弃上清，每孔加质量分数为20%十二烷基硫酸钠(SDS)100　μl，震荡5　min，室温30　 min后，在酶标仪上测定570　nm波长处的吸光度值(A)。rn　　4.流式细胞术：传代后72 h细胞用含体积分数为10%小牛血清培养液调整细胞浓度为1×10 9个/L，接种于6孔培养板，每孔1.2 ml，细胞贴壁后弃去培养液，空白对照组加5%小牛血清培养液2.0 ml，胃泌素组加胃泌素液2.0 ml，丙谷胺组加丙谷胺液2.0 ml，胃泌素＋丙谷胺组二者各加1.0 ml。培养48 h后，分别收集每孔细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，2 ml 1640液制成细胞悬液，测定前离心弃上清，碘化丙啶(PI)染色，ANNEX IN-V(Boehringer mannheim公司)标记，测定凋亡细胞百分率。rn　　5.统计学方法：两组间吸光度值采用t检验；凋亡百分率采用U检验。rn　　二、结果rn　　1.胃泌素对MKN45胃癌细胞的增殖作用：对照组吸光度A值为0.561±0.056；胃泌素组为0.767±0.065与对照组比较，MKN45增殖作用明显加快；丙谷胺组0.556±0.040与对照组间差异无显著性(P＞0.05)；胃泌素联合应用丙谷胺可抑制细胞的增殖［A值为0. 583±0.032，与胃泌素组比较，P＜0.01，但不如5-Fu (0.453±0.045)强( P＜0.01)］。 rn　　2.胃泌素对MKN45胃癌细胞凋亡的影响：胃泌素对MKN45细胞的凋亡有明显的抑制作用，胃泌素组细胞凋亡百分率仅为1.39%，明显低于对照组的9.58%(P＜0.01)，联合应用丙谷胺后凋亡增加(表1)。