靶向人神经母细胞瘤MYCN基因慢病毒载体的构建及鉴定

摘要

目的构建靶向人神经母细胞瘤MYCN基因慢病毒表达载体并检测其对目的基因MYCN的沉默效应。方法根据MYCN基因信息设计并构建4个靶向MYCN基因的干扰质粒,鉴定后与pLenti6.3/V5 Dest载体重组,并包装成为慢病毒表达载体Lenti-EGFP-MYCN-1/2/3/4-miR,感染人神经母细胞瘤SK-N-BE（2）细胞株,并应用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）和Western blot检测4个慢病毒表达载体对MYCN mRNA和蛋白表达的沉默效应,筛选出最佳干扰靶序列慢病毒表达载体。结果酶切和测序结果证实4个靶向MYCN基因的慢病毒载体构建成功,感染SK-N-BE（2）细胞后,应用FQ-PCR和Western blot检测MYCN mRNA和蛋白的表达水平分别为0.577±0.015、0.333±0.016、0.090±0.010、0.197±0.015和0.833±0.049、0.563±0.040、0.300±0.020、0.387±0.015,其中Lenti-EGFP-MYCN-3-miR对MYCN基因抑制作用最为显著,为最佳干扰靶序列慢病毒表达载体。结论成功构建慢病毒表达载体可高效感染体外培养的人神经母细胞瘤SK-N-BE（2）细胞株,并可显著抑制靶基因MYCN mRNA和蛋白的表达。