低氧诱导视网膜色素上皮细胞损伤的生物学机制转录组测序分析

摘要

目的 利用转录组测序(RNA-seq)和生物信息学技术对低氧与常氧条件下人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞的差异表达基因(DEGs)及信号通路的变化进行分析,探讨低氧诱导ARPE-19细胞损伤的生物学机制.方法 将ARPE-19细胞分为低氧处理组和常氧对照组,分别采用体积分数1％和21％ O2处理细胞8、24、48、72 h,采用实时荧光定量PCR法检测不同时间点血管内皮生长因子(VEGF)和低氧诱导因子(HIF-1α)mRNA相对表达量.分别对2个组处理后8h和24 h的ARPE-19细胞进行RNA-seq及生物信息学分析,以| log2FC|≥1且P≤0.05为条件筛选出DEGs,并对DEGs进行聚类热图分析、基因本体论(GO)功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析及蛋白-蛋白互作(PPI)网络分析.采用实时荧光定量PCR法检测低氧处理ARPE-19细胞24 h后DEGs中可能与低氧有关的基因mRNA相对表达量.采用细胞活力检测试剂盒验证2个组不同时间点低氧对ARPE-19细胞的损伤作用.结果 低氧处理组8、24、48、72 h VEGF和低氧处理组8、24、48 h HIF-1α mRNA相对表达量均高于常氧对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),其中低氧处理后8h和24 h各因子mRNA表达差异较大.低氧诱导8h,低氧处理组与常氧对照组间筛选显著DEGs共62个,其中显著上调基因45个,显著下调基因17个;低氧诱导24 h,2个组间筛选显著DEGs共255个,其中显著上调基因228个,显著下调基因27个.DEGs的GO功能分析主要富集在蛋白质降解、核苷酸生物合成及物质转运等进程.KEGG通路分析主要富集在PI3K-Akt、cGMP-PKG以及其他与代谢、细胞周期、细胞生长和细胞凋亡密切相关的信号通路.PPI网络分析发现核心基因HPCA、MT3和NOS3等.实时荧光定量PCR检测结果示,低氧处理ARPE-19细胞24 h后,低氧相关基因DEPP1、NPPB、PDZK1、HILPDA、TCEA3、NDRG1和RORC的mRNA表达水平升高,TFRC、NQO1的mRNA表达水平降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05).低氧诱导ARPE-19细胞后8h和24 h,细胞形态均正常,生长状态较好,未出现死亡细胞,低氧诱导48 h后ARPE-19细胞出现死亡,低氧诱导72 h后死亡细胞数量增加.结论 与代谢相关的PI3K-Akt、cGMP-PKG信号通路可能参与低氧诱导的ARPE-19细胞损伤作用,HPCA、MT3、NOS3核心基因可作为功能性靶基因,在低氧反应中起到关键作用.