外源性α晶状体蛋白作用于视网膜神经节细胞的定位研究

摘要

背景视神经损伤后无法有效再生，而近年研究发现，α晶状体蛋白能显著促进视网膜神经节细胞（RGCs）的存活及轴突有效再生，但其分子机制尚不清楚。目的研究外源性α晶状体蛋白与RGCs的结合部位。方法从2只2d龄LongEvans大鼠视网膜中分离并原代培养RGCs，应用thyl．1和cy3抗体荧光染色技术对培养的RGCs进行鉴别并在荧光显微镜下计数RGCs阳性率。对外源性的α晶状体蛋白生物素化后用直接显色法进行鉴定，并用胰岛素实验对其分子伴侣活性进行测定，明确α晶状体蛋白生物素化成功并具有分子伴侣活性后与原代培养的RGCs共孵育，再与荧光标记的亲和素进行反应，在激光共焦显微镜下观察外源性仪晶状体与RGCs的结合部位。结果原代培养的RGCs阳性率为94％；生物素化α晶状体蛋白直接显色法鉴定整体显色强，其A450值随生物素化的α晶状体蛋白的浓度下降而下降，提示α晶状体蛋白生物素化成功；生物素化α晶状体蛋白的分子伴侣活性明显，且生物素化前后活性无明显改变；生物素化α晶状体蛋白与RGCs共孵育及荧光染色后，激光共焦显微镜下与生物素化α晶状体蛋白共孵育的RGCs细胞膜和轴突均可见红色荧光，细胞质和细胞核未见荧光染色。对照组RGCs未见荧光染色。结论外源性的α晶状体蛋白特异性地结合在RGCs细胞膜上，提示外源性的α晶状体蛋白通过与RGCs细胞膜特异性结合而发挥相应的生物学功能，但其结合方式及作用机制需进一步研究。