超声微泡介导Rb94联合野生型p53基因对鼠视网膜母细胞瘤的抑制

摘要

背景研究表明，野生型p53（wtp53）和Rb94基因对人视网膜母细胞瘤（RB）的生长均有抑制作用，这2个基因是诱导和维持细胞衰老信号通路中重要的参与基因，因此2个基因联合应用是否对RB的生长抑制效果更好是近来关注的问题。目的观察超声微泡介导Rb94联合wtp53基因转染裸鼠RB后对其凋亡的影响。方法将HXO—Rb44细胞悬液种植至40只雌性SPF级BALB／e裸鼠视网膜下腔建立RB动物模型，造模成功的裸鼠按随机数字表法平均分为模型对照组、wtp53质粒组（含wtp53质粒的微泡悬液）、Rb94质粒组（含Rb94质粒）和wtp53＋Rb94质粒组（联合组）（含wtp53质粒及Rb94质粒），其中模型对照组不做任何处理，其他3个组造模后第7天均由鼠尾静脉注入含相应基因的微泡悬液后，每天以0．5W／cm2。超声波辐照眼球4S，间隔24S，循环2次。转染基因超声辐照7d摘除肿瘤组织，利用半定量逆转录PCR（RT—PCR）法检测肿瘤组织中wtp53mRNA及Rb94mRNA的表达；采用Western blot法检测基因转染的肿瘤组织中wtp53及Rb94蛋白的表达；用免疫组织化学法测定肿瘤组织中血管内皮生长因子（VEGF）的表达；采用TUNEL法检测基因转染后肿瘤组织的凋亡情况，计算凋亡指数（AI）。结果HXO-Rb44细胞悬液视网膜下腔注射后移植瘤构建的成功率为80％（32／40），常规组织病理学检查提示检测样本的细胞异型性明显。基因转染后7d，模型对照组无wtp53mRNA及Rb94mRNA的表达条带；wtp53组wtp53mRNA相对值为0．65±0．07，wtp53＋Rb94组为0．32±0．02，差异有统计学意义（t=11．743，P=0．000）；Rb94组Rb94mRNA相对值为0．42±0．03，wtp53＋Rb94组为0．23±0．03，差异有统计学意义（t=5．041，P=0．001）。wtp53、Rb94或wtp53＋Rb94转染后，各组可见与转染相应的蛋白表达条带，wtp53＋Rb94组可同时检测到wtp53及Rb94蛋白的表达条带，但模型对照组无任何基因反应条带。免疫组织化学染色表明，wtp53＋Rb94组肿瘤细胞中VEGF阳性反应强度明显弱于wtp53组、Rb94组和模型对照组。wtp53＋Rb94组AI为37．35±2．14，明显高于模型对照组的0．46±0．05、wtp53组的5．05±O．80和Rb94组的6．43±1．02，差异均有统计学意义（t=-34．395、-28．206、-26．006，P〈0．01）。结论超声微泡造影剂可介导双基因联合转染RB移植瘤，且Rb94联合wtp53基因对RB细胞的促凋亡作用较单基因转染增强。