重组人血管内皮抑制素脂质微泡及其在制备超声介导下抑制肿瘤血管生成的药物中的应用

摘要

本发明公开了一种

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤血管生成新制剂，具体而言，本发明制备一种重组人血管内皮抑制素的脂质微泡，能在超声辐照使载药微泡在肿瘤局部破裂释放药物，并且利用超声生物效应协同抑制肿瘤血管生成。

背景技术

血管内皮抑制素特异性作用于新生血管内皮细胞，抑制其生长和迁移，诱导凋亡，从而抑制血管生成。重组人血管内皮抑制素（recombinant human endostatin, rh-ES）在血管内皮抑制素N端添加了9个氨基酸，使蛋白质纯度、稳定性及生物活性均得到提高，已经应用于临床抗肿瘤。但由于rh-ES血浆半衰期短，临床上需要每日静脉注射给药，操作麻烦。同时，由于缺乏对肿瘤血管内皮细胞特异性，静脉注射后仅极少部分药物作用于肿瘤局部，疗效有限，并可能发生心血管系统不良反应。

超声波在生物组织传播时会产生热效应、空化效应、机械效应等，使血管壁通透性增高，血流速度加快，并且增加细胞膜的通透性，促进药物进入靶细胞内。超声微泡造影剂是一种良好的药物或基因载体，药物可通过包被、非共价结合、黏附于微泡表面或嵌入微泡膜中间等方式与微泡结合。联合应用微泡造影剂可增强超声辐照产生的生物效应，甚至使微血管破裂。 

目前研制的载药超声微泡粒径多在微米级水平，无法通过血管内皮间隙将药物直接运送到肿瘤细胞周围，难以达到真正的肿瘤靶向治疗。rh-ES作用的靶点是血管内皮细胞，制备成载药微泡静脉注射后，超声辐照可使通过血循环到达肿瘤局部的载药微泡破裂释放出药物，同时产生的生物效应可使肿瘤微血管破裂，微循环障碍，释放的药物更容易保留在肿瘤局部，直接作用于血管内皮细胞，发挥更强大的抗肿瘤血管生成作用，高效且安全。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组人血管内皮抑制素的脂质微泡及其制备方法，重组人血管内皮抑制素的脂质微泡能在超声辐照使载药微泡在肿瘤局部破裂释放药物，并且利用超声生物效应协同抑制肿瘤血管生成。

本发明的另一目的是提供重组人血管内皮抑制素脂质微泡在制备超声介导下抑制肿瘤血管生成的药物中的应用。

本发明的目的是这样实现的，所述的重组人血管内皮抑制素脂质微泡，由下述方法制备获得的：将DSPE-PEG 2000-Biotin（二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素 ）、DSPC（二酰基磷脂酰胆碱 ）以摩尔比1:0.5-4分散于磷酸盐缓冲液；通入惰性气体，机械振荡后加入亲和素-抗生蛋白链菌素，抗生蛋白链菌素与DSPE-PEG2000-Biotin摩尔比为1:1-2，室温孵育；加入生物素化重组人血管内皮抑制素，所述亲和素与生物素化重组人血管内皮抑制素的摩尔比为1:1-2，室温孵育后制备得携重组人血管内皮抑制素脂质微泡。

生物素化重组人血管内皮抑制素的制备方法为：生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯（BNHS-ester）为美国Sigma公司产品，250mg装，分子量341.38，用二甲基亚砜配制成1mg/mL溶液配制。将BNHS-ester与重组人血管内皮抑制素按摩尔比15：3溶解于pH8.5的碳酸盐缓冲液，4℃孵育24h，24h后加入等体积谷氨酸终止反应，反应液经10000rpm超滤离心20min，洗涤3次，得生物素化重组人血管内皮抑制素。

本发明所述的重组人血管内皮抑制素脂质微泡在制备超声介导下抑制肿瘤血管生成的药物中的应用。

所述的肿瘤为乳腺癌、肝癌、头颈部肿瘤、胰腺癌、肾癌或前列腺癌。

本发明所述的重组人血管内皮抑制素脂质微泡的制备方法，包括如下步骤：将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素与二酰基磷脂酰胆碱以摩尔比1:0.5-4分散于磷酸盐缓冲液；通入惰性气体，机械振荡后加入亲和素，亲和素与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素的摩尔比为1:1-2，室温孵育；加入生物素化重组人血管内皮抑制素，所述亲和素与生物素化重组人血管内皮抑制素的摩尔比为1:1-2，室温孵育后制备得携重组人血管内皮抑制素脂质微泡。

所述的重组人血管内皮抑制素脂质微泡的制备方法，其特征在于亲和素为抗生蛋白链菌素。

本发明的优点为：rh-ES作用的靶点是血管内皮细胞，经本发明制备成载药微泡静脉注射后，超声辐照可使通过血循环到达肿瘤局部的载药微泡破裂释放出药物，同时产生的生物效应可使肿瘤微血管破裂，微循环障碍，释放的药物更容易保留在肿瘤局部，直接作用于血管内皮细胞，发挥更强大的抗肿瘤血管生成作用，高效且安全；重组人血管内皮抑制素的脂质微泡联合超声辐照组具有较明显的抑制肿瘤生长作用，抑瘤率可达41.3%，明显优于单纯的重组人血管内皮抑制素的脂质微泡的抑制效果，因而只有重组人血管内皮抑制素的脂质微泡与超声辐照协同作用才能获得良好的效果，由此可见本发明的重组人血管内皮抑制素脂质微泡在制备超声介导下抑制肿瘤血管生成的药物中的应用。

附图说明

图1为本发明的载药微泡在荧光显微镜观察见FITC标记的载药微泡发出绿色荧光的图。

图2A本发明的载药微泡超声造影图。

图2B SonoVue超声造影图。

图3为原代培养人脐静脉内皮细胞免疫细胞化学鉴定图。

具体实施方式

实施例

1.    生物素化重组人血管内皮抑制素的制备

生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯（BNHS-ester）为美国Sigma公司产品，250mg装，分子量341.38，用二甲基亚砜配制成1mg/mL溶液。将BNHS-ester与重组人血管内皮抑制素按摩尔比15：3溶解于pH8.5的碳酸盐缓冲液，4℃孵育24h，24h后加入等体积谷氨酸终止反应，反应液经10000rpm超滤离心20min，洗涤3次，得生物素化重组人血管内皮抑制素。

2.    携rh-ES脂质微泡的制备

将DSPE-PEG2000-Biotin与DSPC按摩尔比1:1分散于1毫升的pH 7.40 的磷酸盐缓冲液；通入惰性气体SF6，机械振荡40s；加入亲和素（亲和素:DSPE-PEG2000-Biotin摩尔比为1:2），室温孵育1h；加入步骤1制得的生物素化重组人血管内皮抑制素（亲和素:生物素化重组人血管内皮抑制素摩尔比为1:2），室温孵育1h，制备携重组人血管内皮抑制素脂质微泡。

上述的DSPE-PEG2000-Biotin为美国Avanti公司产品,二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素，分子量3016.81，100mg包装。

亲和素为抗生蛋白链菌素。

DSPC为二酰基磷脂酰胆碱。

2. 载药微泡的理化性质测定

普通光学显微镜观察载药微泡呈圆形，分散良好；平均测定粒径为(3.0±0.4)μm，不低于82.4%的微泡直径在2～7μm范围内；血细胞计数仪测定微泡浓度约（5.2±0.1）×10⁸ /mL；酶联免疫吸附试验测得每10⁸微泡载药量为（800±10.5）μg；荧光显微镜观察见FITC标记的载药微泡发出绿色荧光，见图1，因为提供的黑白图、所以显示不出绿色荧光，但实际上是绿色荧光图。

3. 载药微泡体内超声造影检查

取腹腔接种H22肝癌的小鼠1只，抽取腹水用生理盐水稀释成1×10⁷/mL，小鼠右前肢根部皮下接种200μL细胞悬液，建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型；选取肿瘤最大径约1.5cm小鼠10只，分成载药微泡组与SonoVue对照组，每组5只。抽取0.2mL造影剂经尾静脉快速团注造影，脱机启动Syngo US Workplace软件，建立肿瘤时间-强度曲线，测量始增时间AT、达峰时间TTP和峰值基础强度差PBD。   

结果，小鼠肿瘤先从周边迅速强化，继而向肿瘤实质充填式快速强化，载药微泡和SonoVue超声造影表现相似；二者的超声造影时间-强度曲线相似，见图2A、图2B，造影参数AT、TTP及PBD差异无显著性意义，见表1。

表1  载药微泡和SonoVue超声造影的TIC参数比较

组  别ATTTPPBD载药微泡1.86±0.564.21±0.8623.45±6.73SonoVue1.78±0.634.52±1.5221.59±7.56

4. 超声辐照载药微泡对人脐静脉内皮细胞摄取药物的影响

采用酶灌注消化法原代培养人脐静脉内皮细胞，Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定。结果，显微镜下观察细胞呈铺路石样生长，绝大部分胞浆可见棕色颗粒，证实所培养的细胞为人脐静脉内皮细胞，见图3。

人脐静脉内皮细胞接种于6孔板，分为3组，每组设3个复孔：（1）重组人血管内皮抑制素组（简称rh-ES组）：rh-ES 剂量200ng/mL；（2）rh-ES 联合超声辐照组组（简称rh-ES+US组）：rh-ES 剂量200ng/mL，并超声辐照（840kHZ，声强0.75w/cm²，时间2min）；（3）载药微泡联合超声辐照组（简称载药微泡+US组）：rh-ES剂量为200ng/mL，并超声辐照。分别于处理后1h、2h收集并裂解细胞，抽提蛋白，酶联免疫吸附试验测定细胞内重组人血管内皮抑制素的含量。结果，载药微泡联合超声辐照组细胞内药物浓度明显高于其他两组，见表2。

表2人脐静脉内皮细胞内rh-ES浓度比较

注：^*P<0.05，vs.载药微泡+US组

5. 鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验

取孵化6日鸡胚，开窗后置于38℃、相对湿度为60%～80%孵箱孵育，随机分成5组，每组10只：（1）生理盐水对照组（简称NS组）；（2）rh-ES 300μg/mL组（简称rh-ES组）；（3）空白微泡联合超声辐照组（简称空白微泡+US组）；（4）载药微泡组（简称载药微泡组）：rh-ES 300μg/mL；（5）载药微泡联合超声辐照组（简称载药微泡+US组）。将药物滴加到鸡胚尿囊膜，超声辐照频率840kHZ，声强0.75w/cm² ，时间2min。

结果，载药微泡联合超声辐照组鸡胚尿囊膜血管生成明显受到抑制，新生血管面积及新生血管面积/总面积比值均较其他各组明显降低，见表3；由表3可知，载药微泡联合超声辐照可明显抑制鸡胚尿囊膜血管生成，其效果明显优于单纯载药微泡组。

注：^*P<0.05,vs.生理盐水组；^#P<0.05, vs. 载药微泡+US组

6. 超声辐照联合载药微泡抑制乳腺癌裸鼠移植瘤血管生成作用

大量扩增人乳腺癌MDA-MB-231细胞，裸鼠右前肢根部皮下接种细胞悬液建立荷人乳腺癌裸鼠皮下移植瘤模型。选取肿瘤最大径约1.5cm裸鼠25只，随机分为5组，分别为（1）模型组、（2）rh-ES 0.5mg/kg组（简称rh-ES）、（3）rh-ES 0.5mg/kg联合超声辐照组（简称rh-ES+UI）、（4）载药微泡组（rh-ES剂量为0.5mg/kg）（简称载药微泡）、（5）载药微泡联合超声辐照组（简称载药微泡+UI）。每周治疗1次，连续4周后，处死裸鼠，剥离肿瘤计算肿瘤生长抑制率，取肿瘤组织进行微血管密度检查。

结果，载药微泡联合超声辐照组具有较明显的抑制肿瘤生长作用，抑瘤率可达41.3%，明显优于载药微泡组的抑制效果,见表4；肿瘤组织的微血管密度亦明显低于其他各组，见表5。由此可见，载药微泡联合超声辐照具有明显抑制人乳腺癌血管生成作用。

表4 各组肿瘤生长抑制率比较

组  别  肿瘤质量（g）抑瘤率（%）模型组3.4±0.9-rh-ES3.0±0.811.8rh-ES+UI2.7±0.620.6载药微泡2.9±0.714.7载药微泡+UI2.0±0.5^*41.3

          注：^*P<0.05,vs.模型组。

表5 各组肿瘤微血管密度比较（`x±s）

组  别MVD模型组18.6±5.9rh-ES12.3±4.5^*rh-ES+UI8.9±2.7^**载药微泡13.5±3.5^*载药微泡+UI3.7±0.6^**

                 注：^*P<0.05, ^**P<0.01，vs.模型组。