防污染PCR-微孔板杂交检测布鲁氏菌方法研究

摘要

目的　建立防污染 PCR-微孔板杂交 - EIA检测技术 ,并用于布鲁氏菌及其模拟感染组织中细菌的检测。方法　根据布鲁氏菌 31k D热休克蛋白和外膜蛋白 2 B(OMP2 B)基因设计引物 ,筛选合适引物 ,并建立用脲嘧啶糖基化酶防污染的 PCR扩增 -微孔板杂交与酶联显色检测布鲁氏菌的方法 ,并用于模拟污染布鲁氏菌动物脏器标本的检测。结果　根据布鲁氏菌 31k D热休克蛋白和外膜蛋白 2 B基因设计的引物 ,建立了复合 PCR,同时检测 2个基因的存在 ,并发现不同引物序列对 PCR扩增敏感性影响较大 ,可以相差 10 0 0倍。用 0 .5 U的U DG可以防止 10 8产物的污染 ,微孔板杂交 -酶联显色检测比单纯 PCR-电泳敏感 10倍。将该体系用于污染动物脏器的检测 ,可以检测出反应体系中 2～ 2 0 0个细菌的存在。结论　研究的防污染 PCR-微孔板杂交 - EIA试剂克服了目前 PCR试剂运输不便、产物污染所致假阳性和判定结果欠客观的缺点 。