肝癌缺失基因-1基因结构域调控人结肠癌HT29细胞增殖的实验研究

摘要

目的探讨肝癌缺失基因-1（DLC-1）基因主要结构域在调控人结肠癌HT29细胞增殖中的作用。方法分别构建DLC-1基因Rho蛋白GTP酶活化蛋白（RhoGAP）、SAM、START结构域敲除的亚克隆重组质粒,并转染至人结肠癌HT29细胞,另设野生型HT29细胞组（对照组）、pcDNA3.1-HT29细胞组（空载体组）和pcDNA3.1-HT29-DLC-1细胞组（全长转染组）作为对照。应用四甲基偶氮唑盐（MTT）实验、平板克隆实验检测细胞增殖的改变;流式细胞术检测细胞凋亡;pull-down方法分析RhoA蛋白活性。组间差异采用方差分析。结果转染成功48 h后,与对照组及空载体组相比,全长转染组细胞增殖（F=146.36）及RhoA蛋白活性（F=698.08）明显抑制（P均＜0.05）,细胞早期凋亡增加（F=294.08,P＜0.05）。敲除RhoGAP转染组细胞的增殖能力（F=0.99）、细胞凋亡（F=0.049）及RhoA蛋白活性（F=5.769）与对照组及空载体组相比差异均无统计学意义（P均＞0.05）;敲除SAM转染组细胞比DLC-1基因全长转染组更显著地抑制了细胞增殖（F=31.00,P＜0.05）,使RhoA蛋白活性下调（F=92.57,P＜0.05）,凋亡增加（F=130.44,P＜0.05）;敲除START转染组相对于DLC-1基因全长转染组,细胞增殖能力增强（F=15.47,P＜0.05）,凋亡细胞减少（F=110.23,P＜0.05）,RhoA蛋白活性上调（F=199.39,P＜0.05）。结论 DLC-1基因抑制HT29细胞增殖具有RhoGAP依赖性,SAM结构域可能是内源性RhoGAP活性的自身抑制区域,START结构域可能协助RhoGAP结构域而起作用。