lncRNA LEF1-AS1通过靶向miR-612调控皮肤鳞状细胞癌细胞株增殖、凋亡、迁移侵袭的体外实验研究

摘要

目的探讨长链非编码RNA（lncRNA）LEF1-AS1对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其机制。方法通过干扰皮肤鳞状细胞癌SCC13细胞LEF1-AS1的表达和过表达、抑制miR-612的表达,将SCC13细胞分为转染LEF1-AS1干扰序列、无义序列的干扰LEF1-AS1组、干扰对照组,转染miR-612过表达序列、无义序列的miR-612过表达组、过表达对照组,以及转染LEF1-AS1干扰序列与miR-612抑制序列的干扰抑制组,和转染LEF1-AS1干扰序列与miR-612抑制无义序列的干扰抑制对照组。采用qRT-PCR法检测各组细胞miR-612的相对表达,CCK8法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞的凋亡情况,Transwell试验检测细胞的迁移、侵袭能力,Western印迹检测细胞周期蛋白依赖激酶1（cyclinD1）、细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂（p21）、Bcl-2家族蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达。用LncBase Predicted v.2在线预测网站预测lncRNA LEF1-AS1与miR-612之间的互补序列,将互补/非互补序列用于构建荧光素酶报告基因质粒,分别与miR-612过表达及过表达对照基因共转染SCC13细胞,验证lncRNA LEF1-AS1与miR-612的结合能力。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 miR-612过表达组细胞增殖能力、迁移及侵袭细胞数均低于过表达对照组（均P ＆ 0.05）,凋亡率高于过表达对照组（P ＆ 0.05）。干扰LEF1-AS1组、干扰对照组、干扰抑制组、干扰抑制对照组miR-612的相对表达差异有统计学意义（F = 150.78,P ＆ 0.001）,24、48、72 h时的增殖能力差异有统计学意义（均P ＆ 0.05）,凋亡率、迁移及侵袭细胞数差异均有统计学意义（均P ＆ 0.05）。干扰LEF1-AS1组细胞中miR-612表达、凋亡率高于干扰对照组,48、72 h细胞增殖能力、迁移细胞数和侵袭细胞数低于干扰对照组（均P ＆ 0.05）,而干扰抑制组细胞中miR-612表达、细胞凋亡率低于干扰抑制对照组,48、72 h细胞增殖能力、迁移细胞数和侵袭细胞数高于干扰抑制对照组（均P ＆ 0.05）。Western印迹显示,4组细胞cyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平差异均有统计学意义（均P ＆ 0.001）,干扰LEF1-AS1组cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平均高于干扰对照组,p21、Bax蛋白相对水平低于干扰对照组（均P ＆ 0.05）;而干扰抑制组cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平均高于干扰抑制对照组,p21、Bax蛋白相对水平低于干扰抑制对照组（均P ＆ 0.05）。共转染互补序列后,miR-612过表达组细胞荧光活性低于过表达对照组（t = 21.19,P ＆ 0.001）;而共转染非互补序列后,miR-612组细胞荧光活性与过表达对照组差异无统计学意义（t = 0.28,P = 0.78）。结论 lncRNA LEF1-AS1调控皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭,机制与靶向miR-612相关。