过表达表皮生长因子受体对人类黑素瘤脑转移瘤细胞系H1生长和转移的影响

摘要

目的探索表皮生长因子受体（EGFR）在黑素瘤生长和转移过程中的作用。方法选用本实验室已建立的人黑素瘤脑转移瘤细胞系（H1）,通过慢病毒载体稳定转染野生型EGFR（H1EGFRwt）,使其呈EGFR过表达状态,对照组转染绿色荧光蛋白（H1GFP）后分选纯化。采用细胞划痕实验对实验组H1EGFRwt细胞和对照组H1GFP细胞的迁移能力进行分析,结果以划痕面积愈合率表示。采用集落形成实验观察EGFR对两组细胞独立生存能力和集落形成能力的影响,通过刃天青还原试验评估集落形成结果,结果以两组细胞活细胞数及其代谢活性评分表示。Western印迹分析EGFR激活的信号通路。采用SPSS 20.0软件进行重复测量的方差分析比较两组细胞划痕面积愈合率的差异,采用配对样本t检验比较两组细胞不同预处理的代谢评分差异。结果流式细胞仪检测显示,H1细胞EGFR和GFP转染成功,分选后得到了纯化H1EGFRwt和H1GFP细胞。细胞划痕实验显示,实验组H1EGFRwt在给予表皮生长因子（EGF）刺激的不同时间点（6、18、24、48 h）,划痕面积愈合率分别为0.145±0.066、0.479±0.096、0.571±0.198、0.672±0.199,对照组H1GFP在相同条件下分别为0.051±0.036、0.254±0.038、0.303±0.077和0.498±0.11 1,H1EGFRwt细胞的愈合程度均高于H1GFP细胞,两组比较,F=68.49,df=5,P＜0.05。集落形成实验证实,H1EGFRwt细胞的代谢评分（92 225.2±6 632.1）高于H1GFP细胞（62 935.7±8 159.2）,两组比较,t=2.26,df=9,P＜0.01。Western印迹结果显示,H1EGFRwt细胞可在EGF的刺激下激活下游信号磷酸化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C-γ（pPLCγ）、磷酸化信号转导和转录活化因子5（pSTAT 5）、磷酸化信号转导和转录活化因子3（pSTAT3）,而对照组未能激活。此外,H1EGFRwt细胞可在EGF刺激下使磷酸化丝/苏氨酸蛋白激酶（pAKT）和磷酸化有丝裂原活化蛋白激酶（pMAPK）表达明显高于对照组。结论EGFR在黑素瘤H1细胞的转移机制中发挥重要作用,并有可能成为黑素瘤转移治疗中的靶向目标。